Introdução: A apneia do sono é condição prevalente e apresenta forte correlação com as principais causas de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. A perda do controle neuromotor proveniente de estágios mais profundos do sono está associada ao colapso faríngeo e a patogênese da apneia obstrutiva do sono (SAOS). A língua é implicada como principal protagonista na patogênese da obstrução das vias aéreas superiores (VAS) durante o sono. Não há farmacoterapia para SAOS. Novas tecnologias moleculares para controle neuronal através da inserção de um receptor de membrana geneticamente modificado, denominado Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs], o qual pode ser ativado por uma droga inicialmente inerte, de alta especificdade, clozapina-n-oxide (CNO). Objetivos: 1) Modificar geneticamente os neurônios motores do núcleo do hipoglosso utilizando-se de DREADDs, o qual permite regular sua atividade; 2) Analisar a atividade do músculo genioglosso sob administração de CNO; 3) Desenvolver abordagens para rastreamento dos músculos protrusores e retratores da língua por marcadores retrógrados, injecção de subunidade B de toxina colérica (CTB-AF) e do vírus de pseudoraiva (PRV) 267 transportando um gene repórter, nos músculos efetores. Métodos: Receptores muscarínicos mutados em um vetor adenoviral associado (AAV) foram infundidos no núcleo do hipoglosso de camundongos via injeção esterotáxica bilateral. Após quatro semanas, período para expressão fenotípica, foram comparadas a atividade eletromiográfica do músculo genioglosso (EMGGG) em resposta a administração de ligante (CNO) versus solução salina. Em um segundo grupo foram realizadas infusões com vírus controle e comparação da EMGGG pré e pós infusão de CNO. Para rastreamento neural a CTB-AF foi injetado nos músculos protusores e retratores da língua e para expressão de Cre o vírus PRV-267 foi injetado no músculo genioglosso. A expressão dessas substâncias no núcleo do hipoglosso foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Resultados: Dos dezoito camundongos injetados com DREADDs, dezesseis foram transfectados pelo vetor de AAV. Em camundongos onde o núcleo motor do hipoglosso foi corretamente atingido a EMGGG apresentou importante aumento após a administração de CNO. Em contraste, a atividade do genioglosso não apresentou alteração após a administração de soro fisiológico. Em três camundongos onde a transfecção ultrapassou os limites do núcleo foi observado arritmia respiratória após infusão do ligante. Todos animais infundidos com vírus controle foram adequadamente transfectados mas não apresentaram alteração eletromiográfica após a infusão de CNO. Foram diferenciados no núcleo do hipoglosso os neurônios motores da musculatura retratora e protusora da língua. A expressão intranuclear da enzima Cre-recombinase foi identificada no núcleo hipoglosso. Conclusão: A utilização de métodos quimiogenéticos para ativar grupos selecionados de neurônios motores em áreas cerebrais específicas representa técnica promissora para o estudo do controle neuromotor das VAS. Estes resultados sugerem que a terapia transgênica pode ser eficaz no tratamento da SAOS além de uma vasta gama de patologias que resultam de perturbações no controle neural das VAS. Através da manipulação das fibras musculares efetoras na língua foi possível a identificação do seu respectivo neurônio motor no núcleo do hipoglosso e induzi-lo a sintetizar uma enzima específica (Cre-recombinase) / Introduction: Sleep Apnea is a prevalent condition and strongly correlates with the major causes of morbidity and mortality in Western Society. The loss of motor input from deeper sleep stages is associated with pharyngeal collapsibility and the pathogenesis of obstructive sleep apnea (OSA). The tongue plays a major role in the pathogenesis of upper airway (UA) obstruction during sleep. There is no pharmacotherapy for OSA. New molecular techniques allow to control neuronal function by inserting a genetically modified membrane receptor termed the Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs] which can be activated by a highly specific and otherwise pharmacologically inert drug clozapine-N-oxide (CNO) Objectives: 1) To genetically modify the hypoglossal nucleus motor neurons using DREADDs, which allows to regulate their activity; 2) To analyze the genioglossal activity upon administration of CNO; 3) to develop novel approaches to targeting tongue protruders and retractors by retrograde tracers, cholera toxin subunit B (CTB-AF) and pseudorabies virus (PRV) 267 injection carrying a reporter gene into the effector muscles. Methods: Mutated muscarinic receptors in an adenoviral associated vector (AAV) were delivered to the hypoglossal nucleus via stereotactically bilateral injection. Four weeks after adenoviral delivery (expression period), responses in genioglossal electromyography (EMGGG) activity to intraperitoneal administration of CNO ligand vs. Saline (control) were compared in mice. In a second group, control-virus was infused and genioglossus muscle EMGGG was compared before and after CNO infusion. For neuronal tracing CTB-AF was injected into the protrusor and retractor muscles of the tongue and for Cre induction PRV-267 virus was injected in the genioglossus muscle. Expression of these substances in the hypoglossal nucleus were evaluated by fluorescence histology. Results: Of eighteen DREADDs injected mice, sixteen were transfected with AAV vector. After CNO administration EMGGG activity increased in mice where the hypoglossal motor nucleus was correctly targeted. In contrast, genioglossal activity was not augmented following saline administration. In three mice where transfection surpassed the nucleus limits, breathing arrhythmia was observed following ligand infusion. All animals infused with control virus were adequately transfected but did not present electromyographic change following CNO infusion. The motor neurons of the rectractor and protrusor musculature of the tongue were well differentiated in the hypoglossal nucleus. Intranuclear expression of Cre recombinase enzyme was identified in the hypoglossal nucleus. Conclusion: Utilizing chemogenetic methods to activate motor neuron groups in selected brain areas show promise to UA neuromotor control, and suggest that transgenic therapy may be effective in treating OSA and a wide range of pathologies that result in disturbances of UA neural control. By manipulating the effector muscle fibers of the tongue, it was possible to identify its respective motor neuron in the hypoglossal nucleus and to induce synthesis of a specific enzyme (Cre recombinase)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13062017-162234 |
| Date | 20 March 2017 |
| Creators | Curado, Thomaz Antonio Fleury |
| Contributors | Sennes, Luiz Ubirajara |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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