Οι μικροσωληνίσκοι της μιτωτικής ατράκτου είναι υπεύθυνοι για τον
αποχωρισμό των αδελφών χρωματιδίων κατά την Ανάφαση. Τροποποίηση ή
καταστολή της δυναμικής του δικτύου των μικροσωληνίσκων συνεπάγεται
αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης μέσω ενεργοποίησης του σημείου ελέγχου
της Μίτωσης. Έτσι, ενώσεις που προσδένονται στο μόριο της β-τουμπουλίνης
και σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους, όπως το paclitaxel και η
griseofulvin, ή τους αποσταθεροποιούν, όπως η nocodazole, αποτελούν
αποτελεσματικά φάρμακα έναντι του καρκίνου, αλλά και άλλων ασθενειών.
Η πρόσδεση των φαρμάκων στους μικροσωληνίσκους έχει ως αποτέλεσμα,
την αναστολή της αλληλεπίδρασης μικροσωληνίσκων-κινητοχώρου, βλάβες
στη λειτουργία της μιτωτικής ατράκτου και ανώμαλο χρωμοσωματικό
αποχωρισμό, με συνέπεια την εμφάνιση ανευπλοειδικών κυττάρων.
Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η συγκριτική διερεύνηση της
ανευπλοειδογόνου δράσης των φαρμακευτικών ενώσεων nocodazole,
paclitaxel και griseofulvin σε τρία κυτταρικά συστήματα in vitro: στους
μυοβλάστες ποντικού C2C12, στους ινοβλάστες ανθρώπου HFFF2 και στα
καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπου MCF-7. Η συγκριτική ανάλυση
πραγματοποιήθηκε με τη μελέτη επαγωγής μικροπυρήνων και του
μηχανισμού προέλευσης τους, μέσω της διπλής ανοσοσήμανσης πρωτεϊνών
του κινητοχώρου (CREST) και του δικτύου του κυτταροσκελετού (α-
τουμπουλίνη). Ακολούθησε μελέτη της ακεραιότητας της μιτωτικής συσκευής,
μέσω συνδυασμένης ανοσοσήμανσης πρωτεϊνών του κεντροσώματος (γ-
τουμπουλίνη & Aurora A) και του δικτύου των μικροσωληνίσκων (β-
τουμπουλίνη). Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης πρωτεϊνών
που συμμετέχουν στο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, όπως οι Aurora A, β- και
γ-τουμπουλίνη, μέσω της μεθόδου της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot
Analysis).
Με την ολοκλήρωση της μελέτης παρατηρείται ότι και οι τρεις χημικές
ενώσεις: επάγουν το φαινόμενο της χρωμοσωματικής καθυστέρησης,
κατάσταση που υποδηλώνει την ύπαρξη ολόκληρου χρωμοσώματος, με
αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων με κινητοχώρο στο εσωτερικό
τους και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Επίσης, προκαλούν αύξηση του
ποσοστού πολυπύρηνων μεσοφασικών κυττάρων και στα τρία κυτταρικά
συστήματα. Προκαλούν αύξηση του μιτωτικού δείκτη και συσσώρευση των
κυττάρων στο στάδιο της Μετάφασης στα κύτταρα C2C12, HFFF2 και MCF-7.
Η συσσώρευση αυτή συνοδεύεται με ταυτόχρονη μείωση των
Ανατελοφάσεων. Αποδιοργανώνουν, ακόμα, το δίκτυο των
μικροσωληνίσκων, τόσο στα μεσοφασικά όσο και στα μιτωτικά κύτταρα.
Ειδικότερα, η nocodazole επάγει την αύξηση του ποσοστού μεσοφασικών
κυττάρων με πολύ συμπυκνωμένο δίκτυο και κατεστραμμένο (στικτό)
γενετικό υλικό στα κύτταρα ποντικού C2C12.
Επίσης, και οι τρεις ενώσεις επηρεάζουν τον κεντροσωματικό
πολλαπλασιασμό, με την εμφάνιση ανώμαλων Μεταφάσεων και στις τρεις
κυτταρικές σειρές. Η nocodazole επάγει το σχηματισμό μονοπολικών
Μεταφάσεων, αντίθετα το paclitaxel σχηματίζει πολυπολικές Μεταφάσεις. Η
griseofulvin παρουσιάζει κυτταρική εξειδίκευση με την πρόκληση
μονοπολικών Μεταφάσεων στα κύτταρα C2C12, πολυπολικών Μεταφάσεων
στα καρκινικά κύτταρα MCF-7 και κατά πλειονότητα μη-ομαδοποιημένων
Μεταφάσεων στα κύτταρα HFFF2.
Οι εν λόγω μελετηθείσες χημικές ενώσεις τροποποιούν επίσης την
έκφραση των πρωτεϊνών Aurora A, β- & γ-τουμπουλίνης και στα τρία
κυτταρικά συστήματα. Κύριο χαρακτηριστικό της δράσης της nocodazole
είναι η μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Aurora A και β-τουμπουλίνης.
Αντίθετα το paclitaxel και η griseofulvin οδηγούν σε υπερέκφραση των
Aurora A, β- και γ-τουμπουλίνη. Και οι τρεις φαρμακευτικές ενώσεις
παρουσιάζουν κυτταρική εξειδίκευση ως προς τον επηρεασμό της έκφρασης
των πρωτεϊνών που μελετήθηκαν. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν τη
συμμετοχή των τριών πρωτεϊνών στην εκδήλωση της ανευπλοειδογόνου
δράσης των τριών χημικών ενώσεων.
Τα παραπάνω συμπεράσματα επιβεβαιώνουν και ερμηνεύουν την
ανευπλοειδογόνο δράση των φαρμακευτικών ενώσεων, nocodazole, paclitaxel
και griseofulvin. / The microtubules of the mitotic apparatus are responsible for the
chromosome segregation during Anaphase. Modification or inhibition of the
dynamics of the microtubules results to the activation of the mitotic
checkpoint. Chemicals that bind at the molecule of β-tubulin and stabilize
microtubules, like paclitaxel and griseofulvin or destabilize them, like
nocodazole, act as drugs against cancer or other diseases. This binding results
to the inhibition of microtubule-kinetochore interactions, damage of the
organization of the mitotic spindle, abnormal chromosome segregation and
thus the generation of aneuploid cells.
In the present study we comparatively investigated the aneugenic
potential of three chemical compounds, nocodazole, paclitaxel and
griseofulvin in three cell lines in vitro: C2C12 mouse fibroblasts, HFFF2
human myoblasts and MCF-7 human epithelial cancer cells. The comparative
analysis was established by three different experimental procedures. The
study of micronucleus induction and their generation mechanism was
accomplished by CREST analysis in combination with immunostaining of α-
tubulin. The ability of the chemicals to affect the organization of mitotic
apparatus was investigated by double immunofluorescence of microtubule
network (β-tubulin) and centrosomes (γ-tubulin & Aurora A) in all cell lines.
Finally, to understand further the mechanisms by which nocodazole,
paclitaxel and griseofulvin exert their aneugenic potential, we examined the
ability of these compounds to modulate the expression of proteins that
participate in chromosome segregation, such as Aurora A, β- and γ-tubulin,
by Western blot analysis in C2C12, HFFF2 and MCF-7 cells.
Our results revealed that the three chemical compounds:
Induce chromosome delay, showing a high frequency of
micronuclei with kinetochore, indicating the presence of intact
chromosome in every studied cell line. In addition, all the drugs
evoke induction of multinucleated cells in all cell lines.
Increase the mitotic index with simultaneous Metaphase arrest.
The cell accumulation at the Metaphase is accompanied with
reduction of Anatelophases in all cell lines.
Promote disorganization of the microtubule network. Especially,
nocodazole causes induction of abnormal interphase cells with
very condensed network (bundled cells) and punctuated genetic
material in C2C12 mouse cell line.
Affect the centrosome proliferation, increasing the frequency of
abnormal Metaphases in the three cell lines. Nocodazole induces
high frequency of monopolar Metaphases, whereas paclitaxel
generates polypolar Metaphases. Griseofulvin produces
monopolar Metaphases in C2C12 cells, polypolar Metaphases in
cancer MCF-7 cells and mainly non-congressed Metaphases in
HFFF2 cells, exhibiting cell specificity.
Modify the expression of the proteins Aurora A, β- and γ-tubulin
in all cell lines. Nocodazole reduces Aurora’s A expression in
C2C12, HFFF2 and MCF-7 cell lines. The same is observed for β-
tubulin’s expression, as for C2C12 and MCF-7 cells. Paclitaxel
exerts its aneugenic potential by enhancing the expression of
Aurora A and γ-tubulin in all cell lines, whereas enhancing β-
tubulin’s expression is only noticed in C2C12 and MCF-7 cells.
Griseofulvin increases the expression of Aurora A and β-tubulin
in human cancer cells MCF-7. As for γ-tubulin’s expression, is
elevated only in the human cell lines HFFF2 and MCF-7.
Thus, we suggest that the activity of the pharmaceutical
compounds on the expression of the above proteins, exhibit cell
specificity.
These findings implicate that the aneugenic potential of the
studied drugs is mediated through changes in the expression of
these proteins.
The conclusions above confirm and explain the aneugenic potential of
the pharmaceutical compounds, nocodazole, paclitaxel and griseofulvin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/4584 |
| Date | 29 August 2011 |
| Creators | Ζαχαράκη, Πολυξένη |
| Contributors | Στεφάνου, Γεωργία, Zacharaki, Polyxeni, Αλαχιώτης, Σταμάτης, Δημόπουλος, Νικόλαος, Στεφάνου, Γεωργία |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0037 seconds