Influenza A virus (IAV) is one of the most common viruses circulating in the human population and is responsible for seasonal epidemics that affect millions of individuals worldwide. The need to develop new drugs and vaccines against IAVs led scientists to study the main IAV surface antigens hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). In contrast to HA, which facilitates cell binding and entry of IAVs, NA plays a critical role in the release and spreading of the viral particles. The aim of this thesis was to study how the enzymatic head domain, the stalk and transmembrane domains have evolved to facilitate NA assembly into an enzymatically active homotetramer, and to determine how these regions have evolved together over time. Initially, we observed that the NA transmembrane domain (TMD) assists in the assembly of the head domain by tethering the stalk to the membrane in a tetrameric conformation. Upon examination of the available sequences for NA, we found that the subtype 1 (N1) TMDs have become more polar since 1918 while the subtype 2 (N2) TMDs have consistently retained the expected hydrophobicity of a TMD. Further analysis of the amino-acid sequences revealed a characteristic indicative of an amphipathic assembly for the N1 TMDs that were absent in the TMDs from N2. The function of the amphipathic assembly was examined by creating two viral chimeras, where the original TMD was replaced by another more polar or an engineered hydrophobic TMD. In both cases the viruses carrying the NA TMD chimeras showed reduced growth indicating that the TMD changes created an incompatibility with the head domain of NA. After prolonged passaging of these viruses, natural occurring mutations were observed in the TMD that were able to rescue the defects in viral growth, head domain folding and budding by creating a TMD with the appropriate polar or hydrophobic assembly properties. Interestingly, we observed that N1 and N2 have a great difference in the localization and length of amino-acid deletions occurring in the stalk region. In line with this observation, our data suggests that N1 supports large stalk deletions due to its strong TMD association, whereas N2 requires the presence of a strong oligomerizing stalk region to compensate for its weak TMD interaction. These results have demonstrated how important the NA TMD is for viral infectivity and how the three different domains have evolved in a cooperative manner to promote proper NA assembly / Influensa är en av de mest smittsamma sjukdomarna som drabbar människor och de flesta kan räkna med att bli infekterade många gånger under sin livstid. Influensaviruset attackerar främst luftvägarna, men kan även leda till t.ex. lunginflammation. De enskilda viruspartiklarna (virionerna) kan komma i olika former, men den vanligaste formen som används för att beskriva viruset är den sfäriska. På en virions yta så finns det två olika typer av membranproteiner, som kan liknas med två olika sorters spikar som sticker ut från viruset. Den ena ”spiken” kallas neuraminidas, eller bara kort för NA, och den andra för hemagglutinin (HA). När man har andats in ett influensavirus så kan viruset ta sig till de övre luftvägarna och vidare ner i luftstrupen för att där använda sig av HA för att ta sig in i en cell. Viruset använder sig sedan av cellen för att skapa många nya virioner, som tar sig ut ur cellen för att infektera fler celler. NA är det protein som virionerna använder sig av för att klyva sig loss från modercellen. Målet för avhandlingen var att studera NA och beskriva hur proteinet måste vara ihopsatt för att vara aktivt. NA har en uppbyggnad liknande en trädklunga, där fyra stycken identiska träd (med tillhörande rötter, stammar och trädkronor) går ihop och bildar en enda aktiv enhet, en s.k. tetramer. ”Rötterna” hos NA är den transmembrana domänen (TMD), den del av proteinet som sitter fast i influenaviruskroppen. ”Stammen”, eller stjälkdelen av NA, binder samman TMD med den största delen, huvuddomänen som motsvarar ”trädkronan”. Det är just huvuddomänen som är ansvarig för att klyva loss viruspartiklar från en modercell. Vi har i våra studier sett att det kan vara väldigt viktigt att TMD-domänerna går ihop i grupper om fyra för att hela NA ska kunna gå ihop i en tetramer och aktivt kunna klyva loss viruspartiklarna. När vi studerade TMD från olika influensavirus så märkte vi att vissa egenskaper hos TMD krävs för att de skulle kunna gå ihop, men också att dessa egenskaper inte fanns hos alla influensavirus. Virusen har evolverat över lång tid och har anpassat sig efter värdorganismerna (inklusive människan) och har hittat olika lösningar på problemet med att behöva bilda en tetramer. När vi gjorde ändringar i en TMD som vanligtvis gick ihop till en tetramer, och därmed förhindrade detta, så noterade vi att huvuddomänens funktion påverkades vilket ledde till att influensaviruset hade svårt att spridas. Vidare så har våra pågående studier på stjälkdelen visat att även denna del kan ha stor betydelse för tetrameriseringen av NA, speciellt i de fall där TM-domänen saknar egenskaper för att gå ihop. Avhandlingen tillför inte bara ny och viktig information till influensaforskningen, utan även potentiellt för framställandet av nya influensavacciner/-mediciner. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 4: Manuscript.</p>
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:su-134470 |
| Date | January 2016 |
| Creators | da Silveira Vieira da Silva, Diogo |
| Publisher | Stockholms universitet, Institutionen för biokemi och biofysik, Stockholm : Department of Biochemistry and Biophysics, Stockholm University |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Doctoral thesis, comprehensive summary, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0025 seconds