La voie de réparation par excision de nucléotides (NER) répare les lésions qui distordent la double hélice d’ADN notamment ceux induits par l’irradiation UV. Le NER est subdivisé en deux sous-voies : GG-NER (Global Genome Repair) et TC-NER (Transcription-Coupled Repair). La sous-voie GG-NER enlève les dommages à l’ADN dans l’ensemble du génome. La sous-voie TC-NER répare les dommages sur le brin transcrit qui interfèrent avec la progression de l’ARN Pol II. Les défauts de la voie NER peuvent conduire à l’apparition de pathologies graves. Par exemple, des mutations dans le gène XPG, codant une 3’ endonucléase impliquée dans la voie NER, peuvent mener au xeroderma pigmentosum (XP) associé ou non au syndrome de Cockayne (CS).Récemment, le laboratoire a découvert un lien fonctionnel entre Rad2, homologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae de la protéine XPG humaine, et le Médiateur (Eyboulet et al., 2013). Le Médiateur est un complexe multiprotéique nécessaire à la régulation de la transcription dépendante de l’ARN Pol II. Cette étude a suggéré que le Médiateur est impliqué dans la sous-voie TC-NER en facilitant le recrutement de Rad2 au niveau des régions transcrites.Mon projet de thèse visait à étudier les mécanismes moléculaires qui lient la transcription et la réparation de l’ADN. Plus précisément, d’investiguer le lien fonctionnel entre le Médiateur et la machinerie du NER chez S. cerevisiae.Lors du TC-NER, l’ARN Pol II est le premier facteur signalant le dommage à l’ADN. De plus, le Médiateur et Rad2 interagissent avec l’ARN Pol II. Pour déterminer le lien fonctionnel entre ces composants, nous avons utilisé des approches de génétique et génomique dans les mutants de TFIIH (kin28), de l’ARN Pol II (rpb9) and du Médiateur (med17). Nos résultats nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Rad2 est recruté au niveau des régions régulatrices enrichies par le Médiateur, et Rad2 est ensuite transféré au niveau des régions transcrites de manière dépendante à l’ARN Pol II. De plus, ces résultats suggèrent que le rôle du Médiateur dans la transcription est fortement lié à son rôle dans la réparation de l’ADN.Ensuite, nous avons montré que le lien entre le Médiateur et la machinerie du NER peut être étendu à d’autres protéines du NER notamment en démontrant une interaction physique entre le Médiateur et Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 ou Rad26/CSB, en l’absence des UV. Tout comme Rad2, nous avons démontré que Rad1 et Rad10 n’ont pas de rôle majeur dans la transcription. Pour approfondir le lien entre ces protéines du NER et le Médiateur, des expériences de ChIP-sequencing ont été réalisées. Nous avons observé que le Médiateur est présent au niveau de certaines régions qui sont aussi enrichies par ces protéines du NER. Après l’induction des dommages par UV, les interactions entre le Médiateur et la machinerie du NER reste inchangées par rapport aux conditions en l’absence des UV. De plus grâce à nos expériences de ChIP, nous avons observé un changement de la liaison à la chromatine des protéines du NER et du Médiateur après l’irradiation aux UV. Des expériences de ChIP-sequencing seront réalisées pour avoir une vue globale de ces changements.En conclusion, nous avons solidifié le lien fonctionnel entre Rad2, le Médiateur et l’ARN Pol II par rapport à la réparation couplée à la transcription. Nous avons aussi démontré que le Médiateur interagit avec d’autres protéines du NER (Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 et Rad26/CSB) et colocalise avec eux sur certaines régions de la chromatine. En somme, notre projet place le Médiateur à l’interface de la transcription et de la réparation de l’ADN, deux processus essentiels dont les défauts peuvent mener à des pathologies graves. / Nucleotide excision repair (NER) is a well conserved pathway that removes helix-distorting DNA lesions such as those arising upon UV irradiation. Global genome repair subpathway (GG-NER) removes the DNA lesions in the genome overall, and transcription-coupled repair (TC-NER) removes the DNA lesions interfering with Pol II progression through actively-transcribed regions. Defects in the NER pathway may lead to severe human pathologies. For instance, mutations in human XPG gene, encoding a 3’ endonuclease essential for NER, give rise to xeroderma pigmentosum (XP) sometimes associated with Cockayne syndrome (CS). Recently, the laboratory discovered a functional link between Rad2/XPG and Mediator in Saccharomyces cerevisiae (Eyboulet et al., 2013). Mediator is a large multisubunit complex essential for transcription regulation. We suggest that Mediator is involved in TC-NER by facilitating Rad2 recruitment to transcribed genes.My PhD work aimed at addressing the molecular mechanisms of this link between transcription and DNA repair, especially by investigating the functional interplay between Mediator and the NER machinery in yeast Saccharomyces cerevisiae.RNA Pol II is the first complex of TC-NER that encounters the DNA damage. Moreover, both Mediator and Rad2/XPG interact with Pol II. However, a functional interplay between all these components related to TC-NER remained to be determined. Using genetic and genomic approaches, in particular ChIP-sequencing in TFIIH (kin28), RNA Pol II (rpb9) and Mediator (med17) mutants, our work led us to propose a model where Rad2 shuttles between Mediator on upstream activating sequence (UAS) and RNA Pol II on transcribed regions (Georges, Gopaul et al., under review). Our results also suggest that Mediator functions in transcription and DNA repair are closely related.Moreover, we showed that Mediator’s link to NER can be extended to other NER proteins. Indeed, we identified a physical interaction between Mediator and other NER proteins, including Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 and Rad26/CSB in the absence of UV irradiation. Similarly to Rad2, we demonstrated that Rad1 and Rad10 do not have a major role in yeast transcription. To further study the functional link between Mediator and the NER machinery, we obtained the genomic distribution of different NER proteins by ChIP-sequencing. We found that some promoter regions are co-occupied by Mediator and these NER proteins, and that relationships between Mediator and these NER proteins are more complex than between Mediator and Rad2. We also investigated if physical interactions between Mediator and NER proteins are modified after UV, we did not observe any significant change. Furthermore, we observed that the chromatin binding profiles of NER proteins and Mediator are modified after UV-irradiation. ChIP-sequencing will be carried out to get a genome-wide view of their chromatin binding profiles.In conclusion, we have strengthened the link between Rad2/XPG, Mediator and RNA Pol II, providing mechanistic insights into functional interplay between these components related to transcription-coupled repair, and showed that the link between Mediator and the NER machinery can be extended to other proteins. Taken together, our results suggest a close relation between Mediator functions in transcription and in NER, two fundamental processes dysfunction of which leads to human diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018SACLS347 |
| Date | 01 October 2018 |
| Creators | Gopaul, Diyavarshini |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Soutourina, Julie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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