Le processus d'excision-épissage des RNAs pré-messagers (pré-mRNAs) est une étape essentielle dans l'expression de la majorité des gènes eucaryotiques. Lépissage se déroule dans le noyau au sein dun complexe macromoléculaire appelé spliceosome, ou particule dépissage, qui sassemble sur des sites précis le long des pré-mRNAs. Il consiste en cinq petites particules nucléaires ribonucléoprotéiques dénommées snRNPs (small nuclear Ribonucleoproteins) constituées de snRNAs (small nuclear RNAs) riches en uridines (U1, U2, U4/U6 et U5) et denviron 150 protéines associées (Patel et Steitz, 2003; Jurica et al., 2004).
Lépissage requiert également de nombreuses protéines non constitutives des snRNPs appelées de manière générique facteurs essentiels dépissage. Parmi ceux-ci, les protéines SR constituent une famille de facteurs dépissage conservés chez les Eucaryotes (Barta et al., 2008; Long et Caceres, 2009). Ces protéines possèdent toutes un ou deux domaines de liaison au RNA appelé RRM (RNA Recognition Motif) en N-terminal et un domaine riche en dipeptides sérine et arginine (SR ou RS) en C-terminal. Elles jouent un rôle crucial dans lépissage constitutif et alternatif et ce, par un jeu complexe d'interactions protéine-protéine et protéine-RNA (Bourgeois et al., 2004; Reddy, 2007).
Le mécanisme dépissage alternatif permet de produire différents mRNAs à partir dun seul pré-mRNA et de ce fait peut amener à la synthèse de plusieurs isoformes protéiques. Chez Arabidopsis de ~20 à 40% des pré-mRNAs sont épissés alternativement (Campbell et al., 2006; Wang et Brendel, 2006; Severing et al., 2009; Filichkin et al., 2010).
Le séquençage complet du génome dArabidopsis a révélé que ~80% des régions codantes des gènes nucléaires sont interrompues par des introns (Iida et al., 2004) et a également permis lidentification de 19 protéines SR (Kalyna et Barta, 2004). Ces protéines sont classées en 7 sous-familles, certaines ayant leur homologue chez lhomme, dautres étant spécifiques aux végétaux (Kalyna et Barta, 2004). Le nombre de protéines SR est plus élevé chez Arabidopsis comparé à lhomme, chez qui on en dénombre seulement 11. Cela soulignerait des différences entre ces deux règnes au niveau des mécanismes dépissage et des facteurs impliqués dans ce processus.
Les travaux antérieurs réalisés par immunofluorescence (Docquier et al., 2004) et par fusion traductionnelle avec la GFP (Green Fluorescent Protein) ont permis de montrer que les protéines SR dArabidopsis se localisent dans le noyau et présentent une organisation nucléaire en speckles (ou Splicing Factors Compartments, SFCs) et ce dans différents types cellulaires (Ali et al., 2003; Docquier et al., 2004; Fang et al., 2004; Tillemans et al., 2005). Les speckles sont considérés comme des sites de stockage et/ou dassemblage des complexes dépissage (Lamond et Spector, 2003). La phosphorylation des protéines SR joue un rôle important dans la régulation de leur localisation et de leurs fonctions. Une hyper- ou hypophosphorylation réduit leur activité générale suggérant que leur niveau de phosphorylation est strictement régulé in vivo (Misteli et Spector, 1996; Lai et al., 2003; Lin et al., 2005). Ainsi, la relocalisation des protéines SR au sein des speckles est activement dépendante de leur état de phosphorylation (Misteli, 2000; Docquier et al., 2004; Huang et Steitz, 2005; Tillemans et al., 2005). Le flux des facteurs nucléaires au sein de ces compartiments et leurs interactions transitoires et rapides soulignent une organisation spatiale et temporelle très dynamique (Eils et al., 2000; Phair et Misteli, 2000; Dundr et Misteli, 2001).
Le but de cette thèse de doctorat est détablir un profil dexpression précis de RSZp22 au cours du développement de la plante, de caractériser les propriétés nucléocytoplasmiques de RSZp22 et enfin définir les rôles des domaines de liaison au RNA dans sa dynamique. RSZp22 est un homologue de la protéine 9G8 humaine. Cette protéine SR possède un domaine Zn-knuckle à motif CCHC localisé entre un domaine RRM unique et le domaine RS. Le domaine RRM reconnait les séquences activatrices dépissage présentes sur les exons (ESEs Exonic Splicing Enhancers) alors que le domaine RS est impliqué dans les interactions protéine-protéine et protéine-RNA (Shen et al., 2004). Le rôle du Zn-knuckle, qui se retrouve dans deux sous-familles de protéines SR dArabidopsis (RSZ et RS2Z), nest pas encore bien caractérisé et les spécificités dinteractions des domaines RRM et Zn-knuckle nont pas encore été étudiées. Parmi les protéines SR étudiées, RSZp22 semble être la seule à se localiser et se concentrer au sein du nucléole selon les conditions physiologiques dans lesquelles la cellule se trouve (Tillemans et al., 2005).
Les travaux réalisés récemment au laboratoire montrent que RSZp22 fusionnée à la GFP et surexprimée transitoirement dans des cellules foliaires est une protéine hautement dynamique. Sa mobilité dépend du niveau de phosphorylation et de la concentration en ATP de la cellule. Le développement puis lutilisation des approches de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et de FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) ont permis de suggérer que RSZp22 est une protéine SR dynamique et quelle peut transiter entre le noyau et le cytoplasme. RSZp22 ferait ainsi partie des protéines SR dites navettes comme, entre autres, son homologue humain 9G8 (Tillemans et al., 2006). Basés sur la délétion de domaines entiers de la protéine, nos travaux montrent également que le domaine RS est impliqué dans lorganisation en speckles des protéines SR dArabidopsis au sein du nucléoplasme et quil jouerait le rôle de signal de localisation nucléaire (NLS Nuclear Localisation Signal). Cette étude suggère aussi que le domaine RRM nest pas indispensable pour lorganisation en speckles de RSZp22 et que le domaine Zn-knuckle interviendrait dans lexportation de la protéine (Tillemans et al., 2006).
Les études antérieures de la dynamique des protéines SR d'Arabidopsis et en particulier de RSZp22 ont été réalisées après surexpression ectopique -et quelquefois hétérologue- des facteurs d'épissage. Dans cette étude, nous avons exprimé la protéine RSZp22-GFP sous le contrôle du promoteur endogène RSZp22 après transformation stable dArabidopsis. Parallèlement, une analyse de RT-PCR quantitative et lutilisation du gène rapporteur -glucuronidase (GUS), nous ont permis d'établir un profil dexpression précis de RSZp22 et de complémenter -et valider- la localisation tissulaire de la protéine de fusion. Nous avons ensuite étudié en plantes transgéniques, la dynamique de la protéine RSZp22-GFP dans des types cellulaires spécifiques. Par analyses de FLIP cytoplasmique (dénommé FLIP-shuttling), nous avons démontré que RSZp22 est bien une protéine SR navette nucléocytoplasmique et établi une cinétique d'exportation. Nous avons également confirmé que son exportation vers le cytoplasme est partiellement dépendante de la voie du récepteur CRM1/XPO1. Notre travail a ainsi permis de mettre en évidence les avantages complémentaires des techniques de surexpression en transformation transitoire et de lexpression stable et spécifique pour létude de la dynamique des protéines nucléaires.
Enfin, nous avons montré par mutagenèse dirigée que les motifs RNP1 et Zn-knuckle ne sont pas nécessaires pour la localisation nucléaire de la protéine RSZp22 ni pour sa concentration en speckles. Ces motifs de liaison au RNA sont cependant impliqués dans lexportation de RSZp22 par la voie CRM1/XPO1. De plus, les expériences de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert) indiquent que ces motifs interviennent dans les interactions moléculaires impliquant RSZp22.
Ainsi, ce travail a permis de caractériser la dynamique nucléocytoplasmique de RSZp22 dans des tissus spécifiques dArabidopsis et de mettre en évidence limportance de son interaction avec le mRNA pour son exportation par la voie CRM1/XPO1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:BICfB/oai:ETDULg:ULgetd-05252010-141951 |
| Date | 11 May 2010 |
| Creators | Rausin, Glwadys |
| Contributors | Remacle, Claire, Motte, Patrick, Dommes, Jacques, Thiry, Marc, Charlier, Paulette, Hernandez-Verdun, D., Ploton, D. |
| Publisher | Universite de Liege |
| Source Sets | Bibliothèque interuniversitaire de la Communauté française de Belgique |
| Detected Language | French |
| Type | text |
| Format | application/pdf |
| Source | http://bictel.ulg.ac.be/ETD-db/collection/available/ULgetd-05252010-141951/ |
| Rights | restricted, Je certifie avoir complété et signé le contrat BICTEL/e remis par le gestionnaire facultaire. |
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