Le processus d'excision-épissage des RNAs pré-messagers (pré-mRNAs) est une étape essentielle dans l'expression de la majorité des gènes eucaryotiques. Lépissage se déroule dans le noyau au sein dun complexe macromoléculaire appelé spliceosome, ou particule dépissage, qui sassemble sur des sites précis le long des pré-mRNAs. Il consiste en cinq petites particules nucléaires ribonucléoprotéiques dénommées snRNPs (small nuclear Ribonucleoproteins) constituées de snRNAs (small nuclear RNAs) riches en uridines (U1, U2, U4/U6 et U5) et denviron 150 protéines associées (Patel et Steitz, 2003; Jurica et al., 2004). Lépissage requiert également de nombreuses protéines non constitutives des snRNPs appelées de manière générique facteurs essentiels dépissage. Parmi ceux-ci, les protéines SR constituent une famille de facteurs dépissage conservés chez les Eucaryotes (Barta et al., 2008; Long et Caceres, 2009). Ces protéines possèdent toutes un ou deux domaines de liaison au RNA appelé RRM (RNA Recognition Motif) en N-terminal et un domaine riche en dipeptides sérine et arginine (SR ou RS) en C-terminal. Elles jouent un rôle crucial dans lépissage constitutif et alternatif et ce, par un jeu complexe d'interactions protéine-protéine et protéine-RNA (Bourgeois et al., 2004; Reddy, 2007). Le mécanisme dépissage alternatif permet de produire différents mRNAs à partir dun seul pré-mRNA et de ce fait peut amener à la synthèse de plusieurs isoformes protéiques. Chez Arabidopsis de ~20 à 40% des pré-mRNAs sont épissés alternativement (Campbell et al., 2006; Wang et Brendel, 2006; Severing et al., 2009; Filichkin et al., 2010). Le séquençage complet du génome dArabidopsis a révélé que ~80% des régions codantes des gènes nucléaires sont interrompues par des introns (Iida et al., 2004) et a également permis lidentification de 19 protéines SR (Kalyna et Barta, 2004). Ces protéines sont classées en 7 sous-familles, certaines ayant leur homologue chez lhomme, dautres étant spécifiques aux végétaux (Kalyna et Barta, 2004). Le nombre de protéines SR est plus élevé chez Arabidopsis comparé à lhomme, chez qui on en dénombre seulement 11. Cela soulignerait des différences entre ces deux règnes au niveau des mécanismes dépissage et des facteurs impliqués dans ce processus. Les travaux antérieurs réalisés par immunofluorescence (Docquier et al., 2004) et par fusion traductionnelle avec la GFP (Green Fluorescent Protein) ont permis de montrer que les protéines SR dArabidopsis se localisent dans le noyau et présentent une organisation nucléaire en speckles (ou Splicing Factors Compartments, SFCs) et ce dans différents types cellulaires (Ali et al., 2003; Docquier et al., 2004; Fang et al., 2004; Tillemans et al., 2005). Les speckles sont considérés comme des sites de stockage et/ou dassemblage des complexes dépissage (Lamond et Spector, 2003). La phosphorylation des protéines SR joue un rôle important dans la régulation de leur localisation et de leurs fonctions. Une hyper- ou hypophosphorylation réduit leur activité générale suggérant que leur niveau de phosphorylation est strictement régulé in vivo (Misteli et Spector, 1996; Lai et al., 2003; Lin et al., 2005). Ainsi, la relocalisation des protéines SR au sein des speckles est activement dépendante de leur état de phosphorylation (Misteli, 2000; Docquier et al., 2004; Huang et Steitz, 2005; Tillemans et al., 2005). Le flux des facteurs nucléaires au sein de ces compartiments et leurs interactions transitoires et rapides soulignent une organisation spatiale et temporelle très dynamique (Eils et al., 2000; Phair et Misteli, 2000; Dundr et Misteli, 2001). Le but de cette thèse de doctorat est détablir un profil dexpression précis de RSZp22 au cours du développement de la plante, de caractériser les propriétés nucléocytoplasmiques de RSZp22 et enfin définir les rôles des domaines de liaison au RNA dans sa dynamique. RSZp22 est un homologue de la protéine 9G8 humaine. Cette protéine SR possède un domaine Zn-knuckle à motif CCHC localisé entre un domaine RRM unique et le domaine RS. Le domaine RRM reconnait les séquences activatrices dépissage présentes sur les exons (ESEs Exonic Splicing Enhancers) alors que le domaine RS est impliqué dans les interactions protéine-protéine et protéine-RNA (Shen et al., 2004). Le rôle du Zn-knuckle, qui se retrouve dans deux sous-familles de protéines SR dArabidopsis (RSZ et RS2Z), nest pas encore bien caractérisé et les spécificités dinteractions des domaines RRM et Zn-knuckle nont pas encore été étudiées. Parmi les protéines SR étudiées, RSZp22 semble être la seule à se localiser et se concentrer au sein du nucléole selon les conditions physiologiques dans lesquelles la cellule se trouve (Tillemans et al., 2005). Les travaux réalisés récemment au laboratoire montrent que RSZp22 fusionnée à la GFP et surexprimée transitoirement dans des cellules foliaires est une protéine hautement dynamique. Sa mobilité dépend du niveau de phosphorylation et de la concentration en ATP de la cellule. Le développement puis lutilisation des approches de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et de FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) ont permis de suggérer que RSZp22 est une protéine SR dynamique et quelle peut transiter entre le noyau et le cytoplasme. RSZp22 ferait ainsi partie des protéines SR dites navettes comme, entre autres, son homologue humain 9G8 (Tillemans et al., 2006). Basés sur la délétion de domaines entiers de la protéine, nos travaux montrent également que le domaine RS est impliqué dans lorganisation en speckles des protéines SR dArabidopsis au sein du nucléoplasme et quil jouerait le rôle de signal de localisation nucléaire (NLS Nuclear Localisation Signal). Cette étude suggère aussi que le domaine RRM nest pas indispensable pour lorganisation en speckles de RSZp22 et que le domaine Zn-knuckle interviendrait dans lexportation de la protéine (Tillemans et al., 2006). Les études antérieures de la dynamique des protéines SR d'Arabidopsis et en particulier de RSZp22 ont été réalisées après surexpression ectopique -et quelquefois hétérologue- des facteurs d'épissage. Dans cette étude, nous avons exprimé la protéine RSZp22-GFP sous le contrôle du promoteur endogène RSZp22 après transformation stable dArabidopsis. Parallèlement, une analyse de RT-PCR quantitative et lutilisation du gène rapporteur -glucuronidase (GUS), nous ont permis d'établir un profil dexpression précis de RSZp22 et de complémenter -et valider- la localisation tissulaire de la protéine de fusion. Nous avons ensuite étudié en plantes transgéniques, la dynamique de la protéine RSZp22-GFP dans des types cellulaires spécifiques. Par analyses de FLIP cytoplasmique (dénommé FLIP-shuttling), nous avons démontré que RSZp22 est bien une protéine SR navette nucléocytoplasmique et établi une cinétique d'exportation. Nous avons également confirmé que son exportation vers le cytoplasme est partiellement dépendante de la voie du récepteur CRM1/XPO1. Notre travail a ainsi permis de mettre en évidence les avantages complémentaires des techniques de surexpression en transformation transitoire et de lexpression stable et spécifique pour létude de la dynamique des protéines nucléaires. Enfin, nous avons montré par mutagenèse dirigée que les motifs RNP1 et Zn-knuckle ne sont pas nécessaires pour la localisation nucléaire de la protéine RSZp22 ni pour sa concentration en speckles. Ces motifs de liaison au RNA sont cependant impliqués dans lexportation de RSZp22 par la voie CRM1/XPO1. De plus, les expériences de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert) indiquent que ces motifs interviennent dans les interactions moléculaires impliquant RSZp22. Ainsi, ce travail a permis de caractériser la dynamique nucléocytoplasmique de RSZp22 dans des tissus spécifiques dArabidopsis et de mettre en évidence limportance de son interaction avec le mRNA pour son exportation par la voie CRM1/XPO1.

Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat portent sur létude de la distribution cellulaire dynamique des facteurs essentiels dépissage de la famille SR dArabidopsis thaliana. Le processus dexcision/épissage du pré-mRNA consiste en la reconnaissance précise des introns au niveau des sites dépissage, en leur excision et en la ligature des exons. Les facteurs d'épissage SR possèdent un domaine particulier riche en dipeptides sérines et arginines répétés et également un ou deux domaines hautement conservés de liaison au RNA. Ils sont impliqués dans la reconnaissance et le choix des sites dépissage ainsi que dans lassemblage du spliceosome. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons montré la distribution subcellulaire dynamique des protéines SR d'Arabidopsis (RSp31, RSZp22, RSp34 et RSZ33) fusionnée à la GFP, et ce dans divers systèmes expérimentaux (cellules foliaires de tabac et dArabidopsis, cellules BY-2). Celles-ci se localisent au sein du noyau et se concentrent en certains sites nucléaires précis dénommés speckles. Nous avons aussi observé que lune dentre-elles, RSZp22, peut se localiser au sein du nucléole suivant les conditions cellulaires, ce qui suggérait un rôle possible de cette protéine dans le transport du mRNA. Nous avons étudié le rôle des différents domaines structuraux des protéines SR dans leur distribution cellulaire en réalisant des délétions partielles des protéines RSp31 et RSZp22 et en analysant la localisation des protéines mutantes. Par co-expression de différents couples de protéines SR fusionnées à deux variantes de protéines fluorescentes (la GFP et la mRFP1 ou monomeric Red Fluorescent Protein 1), nous avons également montré une co-localisation générale des protéines SR végétales, à lexception de RSZp22 qui est la seule à présenter cette localisation nucléolaire. Nous avons aussi analysé la redistribution des protéines SR après traitement par divers inhibiteurs de la phosphorylation et déphosphorylation et également de la transcription. Aussi, l'utilisation de diverses méthodes de microscopie confocale (comme le FRAP ou Fluorescence Recovery After Photobleaching ou encore le FLIP ou Fluorescence Loss In Photobleaching) nous a permis de montrer que les protéines SR dArabidopsis sont hautement dynamiques au sein du noyau. Enfin, nous avons observé grâce à la technique du FLIP que RSZp22 est capable de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme et que ce transport nucléo-cytoplasmique dépend de la voie dexportation via le récepteur CRM1/exportine1 [1-3]. 1. Docquier, S., et al., Nuclear bodies and compartmentalization of pre-mRNA splicing factors in higher plants. Chromosoma, 2004. 112(5): p. 255-66. 2. Tillemans, V., et al., Functional distribution and dynamics of Arabidopsis SR splicing factors in living plant cells. Plant J, 2005. 41(4): p. 567-82. 3. Tillemans, V., et al., Insights into Nuclear Organization in Plants as Revealed by the Dynamic Distribution of Arabidopsis SR Splicing Factors. Plant Cell, 2006. 18(11): p. 3218-34.

Dans les cellules eucaryotes, lexport des ARN messagers du noyau vers le cytoplasme est un processus complexe et régulé. Les messagers matures sont transportés par le récepteur dexport TAP/NXF1, qui est recruté au niveau des messagers par différents adaptateurs comme les protéines Aly/REF, UAP56 et les protéines SR. Dans le cadre dune infection virale, en plus des messagers cellulaires, de nombreux messagers viraux doivent être transportés efficacement dans le cytoplasme pour y être traduits. Il est maintenant établi que les herpesvirus codent pour une famille conservée de gènes dont les produits agissent en tant que facteurs dexport et régulent le transport des transcrits viraux. Cette famille inclut la protéine IE4 du virus de la Varicelle et du Zona (VZV). Les principales caractéristiques de ces facteurs dexport viraux sont leur capacité à faire la navette entre le noyau et le cytoplasme, leur domaine de liaison à lARN, et leur capacité à interagir avec des facteurs intervenant dans lexport des messagers cellulaires. Avant cette étude, les données montraient que la protéine IE4 agit comme un régulateur important de lexpression des gènes viraux et cellulaires, mais les mécanismes impliqués nétaient pas clairement définis. Dans ce travail, nous avons identifié de nouveaux partenaires cellulaires de la protéine IE4, et, bien que des différences existent, nous avons montré que la protéine IE4 partage les caractéristiques des facteurs dexport viraux. Nous avons montré que la protéine IE4 interagit avec trois protéines SR, à savoir ASF/SF2, 9G8 et SRp20. Nous avons identifié le domaine dinteraction au sein de la protéine IE4 et montré que ces interactions ne sont pas dépendantes de la présence dARN. Nous avons démontré que la protéine IE4 interagit avec la principale kinase phosphorylant les protéines SR, SRPK1, et quelle est phosphorylée par cette kinase. Nous avons montré que la protéine IE4 se lie à lARN, et que la présence dARN stabilise des complexes contenant la protéine IE4 et les facteurs dexport cellulaires TAP/NXF1 et Aly/REF. Enfin, nous avons déterminé linfluence de la protéine IE4 sur lexport de messagers rapporteurs, et clairement montré que linfection par le VZV utilise le facteur dexport TAP/NXF1 pour exporter certains transcrits viraux. Nous avons donc mis en évidence un nouvel exemple de facteur dexport viral et proposé en modèle dexport des messagers viraux régulé par la protéine IE4. Nos résultats démontrent clairement que les herpesvirus ont développé différents mécanismes pour réguler lexport des ARN dans le but daltérer lexpression des gènes cellulaires au profit de lexpression des gènes viraux.