Οι μεταγραφικοί παράγοντες COUP-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter
Transcription Factor) ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων
στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών και θεωρούνται “ορφανοί”, αφού μέχρι
στιγμής δεν έχει βρεθεί το υπεύθυνο πρόσδεμα για την ενεργοποίηση τους.
Πειραματικές διαδικασίες στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι στο πρωτογενές
μετάγραφο των COUP-TFs συμβαίνει εναλλακτικό μάτισμα που έχει ως
αποτέλεσμα την παραγωγή δύο mRNAs που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες οι
οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος λόγω της εισαγωγής 21 επίπρόσθετων
αμινοξέων στην καρβοξυτελική περιοχή (Carboxy Terminal Extension) της
περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Πειράματα EMSA με τη χρήση in vitro
μεταφρασμένων πρωτεϊνών, αποκάλυψαν ότι η μεγάλη πρωτεΐνη δεν μπορεί να
προσδεθεί σε κανένα COUP-TF στοιχείο απόκρισης. Επίσης παρατηρήθηκε ότι
παρουσία της μεγάλης πρωτεΐνης, η ικανότητα της μικρής πρωτεΐνης να
προσδένεται στο DNA μειώνεται με ανταγωνιστικό τρόπο, οδηγώντας στο
συμπέρασμα ότι το ετεροδιμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο δεν μπορεί να προσδεθεί
στο DNA. Σκοπός μας είναι να ερευνήσουμε το ρόλο της ένθεσης των 21
αμινοξέων στην μεγάλη πρωτεΐνη, ως προς την ικανότητα πρόσδεσης της στο
DNA. Στον αχινό Paracentrotus lividus, η αμινοξική ένθεση στην καρβοξυτελική
περιοχή (CTE) της μεγάλης πρωτεΐνης περιέχει δύο προλίνες. Η υπόθεση μας
είναι ότι αυτές οι δύο προλίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην
στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, επηρεάζοντας την ικανότητα πρόσδεσης στο
DNA. Για να ελέγξουμε την υπόθεση αυτή, προκαλέσαμε σημειακές μεταλλάξεις,
μεταλλάσσοντας συγχρόνως τις δύο προλίνες σε αλανίνες αλλά κάθε μία προλίνη
σε αλανίνη μεμονωμένα, καθώς επίσης μελετήσαμε και μια σειρά εσωτερικών
αμινοξικών ελλειμάτων μέσα στην ένθεση των 21 αμινοξέων στην
καρβοξυτελική περιοχή. Το σύνολο των μεταλλάξεων έδειξε ότι οι
μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες δεν προσδένονται στο DNA καθώς επίσης ότι
οι μεταλλαγμένες μεγάλες πρωτεΐνες ετεροδιμερίζονται πιο αποτελεσματικά με
την μικρή ισομορφή πιθανότατα λόγω επαγόμενης αλλαγής της
στερεοδιαμόρφωσης της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Επίσης μελετήσαμε την
εξάπλωση του εναλλακτικού ματίσματός στα Δευτεροστόμια, χρησιμοποιώντας
ειδικούς εκφυλισμένους εκκινητές σε πειράματα PCR. Εναλλακτικό μάτισμα των
μεταγράφων COUP-TF παρατηρήθηκε επίσης στους οργανισμούς Sphaerechinus
granularis (Εχινόδερμο) και Saccoglossus kowalevskii (Ημιχορδωτό). / COUP-TFs (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter- Transcription Factors) belong to the superfamily of steroid/thyroid hormone receptors and they are consider orphans since the proper ligand that activates them is not yet found. Experimental procedures in our laboratory have shown that in Echinoderms the alternative splicing of the COUP-TF primary transcript results in two mRNAs which encode two protein variants that differ by a 21 amino acid insertion in the Carboxy Terminal Extension (CTE) of the DNA Binding Domain (DBD). EMSA experiments with the use of in vitro translated proteins revealed that the large protein variant is incapable of binding any COUP-TF response elements. Furthermore, in the presence of the large variant, the small COUP-TF protein ability to bind DNA is diminished in an antagonistic way, suggesting that the heterodimeric protein is also incapable of DNA binding. Our aim is to investigate the role of the 21aa insertion in the large variant regarding the DNA binding affinity. In sea urchins the CTE insertion in the large variant contains two prolines. Our hypothesis is that these two prolines play an important role in the protein‟s conformation which in turn is responsible for the loss of DNA binding. To check this, we created point mutations by mutating both prolines to alanines simultaneously and then each proline to alanine separately. We also analyzed a series of internal amino acid deletions within the 21aa insertion of the CTE. All the mutations proved that the large mutated proteins are incapable of binding DNA and that they heterodimerize more effectively with the small protein variant possibly because of the changed conformation of the large protein variant. We also studied the alternative splicing among Deuterostomes, by using degenerate primers in PCR experiments. We observed that alternative splicing of COUP-TF transcripts occurs in the sea urchin Sphaerechinus granularis and in the hemichordate Saccoglossus kowalevskii.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/4766 |
| Date | 07 October 2011 |
| Creators | Πέττα, Ιωάννα |
| Contributors | Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος, Petta, Ioanna, Μίντζας, Αναστάσιος, Κίλιας, Γεώργιος, Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0028 seconds