Die Graft-versus-host-Disease (GvHD) zeichnet sich dadurch aus, dass bei einer Gewebetransplantation (Transplantation des Knochenmarks) die transplantierten Zellen des Donors vom Empfänger abgestoßen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein möglicher gentherapeutischer Ansatz mittels Nutzung von Oligonukleotiden untersucht.
Diese beruhen u.a. auf der Inaktivierung reifer T-Zellen des Spenders, welche Gewebe als fremd erkennen und schwere Entzündungen hervorrufen. Die Aktivierung der T-Zellen erfolgt über die Bindung des CD4-Moleküls und des kostimulatorischen Rezeptors CD28 an den MHCII Komplex von antigen-präsentierenden Zellen des Empfängers.
Die Inaktivierung der CD4 und CD28 Gene, und somit die Hemmung der T-Zellaktivität des Spenders, erfolgte durch antisense Oligonukleotide (AONs) und durch small interfering RNAs (siRNA). Zur effizienten und sicheren Einschleusung (Transfektion) der Oligonukleotide in die Zielzellen wurden Nanopartikel verwendet. Die Wirkung wurde zunächst in vitro an murinen und humanen Zellen und anschließend in vivo an einem GvHD-Mausmodell (allogen, transgen) untersucht. In den Mausmodellen wurden weiterhin zwei Applikationsschemata gewählt, zum einen die Behandlung der Spenderzellen ex vivo und zum anderen die direkte i.p.Applikation der Oligonukleotide in die Maus.
Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Eine verminderte Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 erfolgte nach Gabe zweier funktioneller AONs mit muriner Sequenz, in vitro. In murinen Milzzellen ließ sich durch diese beiden funktionellen AONs die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine Interferon γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) hemmen. Zusätzlich bewirkte der Einsatz eines AON und einer siRNA mit einer funktionellen humanen Sequenz eine Hemmung der CD4 Expression in humanen PBMCs.
Insbesondere die kombinierte Behandlung mit a-CD4 und a-CD28 AONs zeigte im murinem allogenen GvHD Modell einen signifikant positiven Effekt auf das Überleben sowie die Krankheitssymptome der Versuchstiere. Der positive Effekt konnte ebenso durch eine Reduktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und einer verminderten Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 bestätigt werden. Ähnlich wie das allogene Modell zeigte auch das CD4 transgene Modell positive Effekte hinsichtlich des Überlebens und der Herunterreglierung pro-inflammatorischer Zytokine.
Anschließend erfolgten Studien zur Lokalisation (Biodistribution) der Nanopartikel-Nukleinsäure-Komplexe und die Untersuchung der Seren auf allgemeine Leber- und Nieren-toxische Schäden. Sie führten zu folgenden Ergebnissen:
Unabhängig von der Applikationsart (i.p. und i.v.) befanden sich nach 24h die Komplexe hauptsächlich in der Lunge.
Ebenfalls ließen sich relevante Mengen im Knochenmark und im Dünndarm der transplantierten Tiere nachweisen. Diese beiden Gewebe sind besonders interessant für therapeutische Ansätze zur Behandlung einer aufkommenden GvHD.
Unabhängig von der Art der Komplexierung (AON ± PEI) wurde ein Anstieg Anstieg der Aspartat-Aminotransferase (lebertoxischer Parameter) und Glukose beobachtet.
Generell scheint die Behandlung der GvHD mittels Oligonukleotide erfolgreich zu sein, neben der geigneten funktionellen Sequenz muss jedoch die chemische Modifikation der Oligonukleotide und die zielgerichtete Biodistribution in vivo evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... iii
1 Einleitung ................................................................................................ 1
1.1 Prinzipien der Gentherapie ................................................................. 1
1.1.1 Mechanismen der Gentherapie ....................................................... 2
1.1.2 Methoden des Transfers therapeutischer Nukleinsäuren ................ 8
1.2 Graft-versus-Host-Disease .................................................................. 11
1.2.1 Pathologie ....................................................................................... 11
1.2.2 Klinik und Methoden zur Behandlung der GvHD ............................. 14
1.2.3 GvHD-Modelle ................................................................................. 17
1.3 Zielstellung........................................................................................... 19
2 Material & Methoden ................................................................................ 20
2.1 Design funktioneller Oligonukleotide .................................................... 20
2.2 In vitro Zellkultur .................................................................................. 21
2.2.1 Zelllinien und primäre Immunzellen ................................................. 21
2.2.2 Stimulation und Transfektion ........................................................... 23
2.3 In vivo GvHD Modell ............................................................................ 24
2.3.1 Zeitlicher Ablauf und Durchführung ................................................. 25
2.3.2 Begleitendes klinisches Monitoring & Probenentnahme ................. 29
2.4 Funktionellen Messungen .................................................................... 30
2.4.1 Quantitative mRNA Expression ....................................................... 30
2.4.2 Proliferationstest ............................................................................. 33
2.4.3 Differentialblutbild ............................................................................ 34
2.4.4 Histologie ........................................................................................ 35
2.4.5 Serummessung ............................................................................... 36
2.4.6 Durchflußzytometrie ........................................................................ 37
2.5 Statistik ................................................................................................ 39
3 Ergebnisse ............................................................................................... 40
3.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 40
3.2 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vivo ................................. 49
3.2.1 Indirekte ex vivo Applikation ............................................................ 50
3.2.2 Direkte in vivo Applikation im murinem allogenen Modell ............... 69
3.3 Pharmakologie in vivo applizierter Nukleinsäure-Komplexe ............ 77
3.3.1 Biodistribution .................................................................................. 77
3.3.2 Toxikologie ...................................................................................... 81
4 Diskussion ............................................................................................... 85
4.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 85
ii
4.2 Indirekte ex vivo Applikation zur Prävention der GvHD ....................... 89
4.2.1 allogenes Tiermodell ....................................................................... 89
4.2.2 transgenes Tiermodell ..................................................................... 93
4.3 Therapeutischer anti-GvHD Oligonukleotid-basierter Ansatz (in vivo Applikation) .......................................................................................... 94
4.4 Biodistribution applizierter Oligonukleotide .......................................... 96
4.5 Untersuchung unspezifischer Toxizität nach in vivo Applikation .......... 98
Zusammenfassung der Arbeit ............................................................................. 101
Anhang ................................................................................................................. vii
5 Literaturverzeichnis .................................................................................. xxi
6 Tabellenverzeichnis ................................................................................. xxxiv
7 Abbildungsverzeichnis ............................................................................. xxxiv
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:71389 |
| Date | 03 July 2020 |
| Creators | Przybylski-Wartner, Susanne |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.1371/journal.pone.0176517 |
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