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Previous issue date: 2014-02-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Entre os principais patógenos causadores da mastite bovina estão as bactérias do gênero Staphylococcus. Nas últimas décadas, a resistência à oxacilina (meticilina) neste gênero tem sido motivo de preocupação, pela possibilidade de redução da efetividade dos tratamentos da mastite, e pela possibilidade de transferência de determinantes de resistência de uma bactéria para outra. A resistência à oxacilina é mediada pela proteína PBP 2a, codificada pelo gene mecA, que confere resistência a todos os antibióticos β-lactâmicos, inclusive às cefalosporinas e carbapenemas. O gene mecA faz parte de uma ilha genômica chamada staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), que pode incluir também outros genes de resistência. Neste trabalho, a resistência à oxacilina foi avaliada em 170 bactérias do gênero Staphylococcus isoladas de mastite subclínica, sendo 79 S. aureus e 91 Staphylococcus spp. coagulase-negativos (STACN). As bactérias foram provenientes de seis estados brasileiros, sendo quatro de Minas Gerais, 27 do Paraná, três de Pernambuco, onze do Rio Grande do Sul, 56 de Santa Catarina e 69 de São Paulo. O perfil de susceptibilidade a dez antimicrobianos utilizados na prática veterinária foi determinado pelo método E-TEST®. A caracterização fenotípica da resistência à oxacilina foi realizada através do teste de difusão com discos de oxacilina e cefoxetina, teste de diluição em ágar com oxacilina e E-TEST® com oxacilina. Em todas as amostras foi pesquisado, por PCR, o gene mecA, empregando dois pares de oligonucleotídeos iniciadores que amplificam regiões diferentes do gene. As bactérias com fenótipo de resistência à oxacilina foram identificadas através do sequenciamento de um fragmento de 536 pb do rRNA 16S. Neste grupo foi pesquisado ainda o gene mecC e o gene blaZ, que codifica para a enzima β-lactamase. Os produtos de PCR foram sequenciados para confirmação dos resultados. Foi feita a análise molecular dos genes mecA por meio da tipagem do cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) e das amostras mecA positivas através da macrorrestrição do DNA cromossômico seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Com exceção da penicilina e da oxacilina, mais de 86% das estirpes de estafilococos apresentaram susceptibilidade à cefalotina, gentamicina, clindamicina, eritromicina, enrofloxacina, sulfonamida, sulfametoxazol +
trimetoprima e tetraciclina. Todas as estirpes de S. aureus foram susceptíveis à oxacilina, enquanto 29,7% das estirpes de STACN foram resistentes. STACN foram mais resistentes do que S. aureus à cefalotina e à eritromicina (p ≤ 0,01) e à gentamicina, clindamicina, e tetraciclina (p ≤ 0,05). A susceptibilidade das amostras S. aureus e de STACN foi semelhante para penicilina, enrofloxacina, sulfonamida e sulfametoxazol + trimetoprima. O teste de difusão em ágar com disco de cefoxetina apresentou maior sensibilidade e especificidade quanto à presença do gene mecA. Do total de amostras estudadas, 31 STACN foram fenotipicamente resistentes à oxacilina em pelo menos um dos testes realizados, e somente em dez foi detectado o gene mecA. As bactérias mecA positivas foram identificadas como S. epidermidis e classificadas em três pulsotipos (A, B e C) e quatro subtipos (A1, B1, B2 e B3). Entre as amostras com fenótipo de resistência à oxacilina 16 foram positivas para o gene blaZ, sendo sete mecA negativas e nove mecA positivas. Nenhuma das amostras analisadas amplificou o gene mecC e duas amplificaram o gene mecA-like de S. sciuri. Foram encontrados três tipos de SCCmec, os tipos I, IV e V. Os resultados sugerem que S. epidermidis pode ser um reservatório da resistência à oxacilina para outras espécies de estafilococos, tanto do homem quanto de animais. Estudos que gerem informações sobre o perfil fenotípico e molecular da resistência aos antimicrobianos em espécies de estafilococos devem ser realizados para o controle da disseminação da resistência e para que medidas terapêuticas sejam escolhidas adequadamente. / Among the major pathogens of bovine mastitis are bacteria of the genus Staphylococcus. In recent decades, resistance to oxacillin (methicillin) in this genus has been a matter of concern for the possibility of reducing the effectiveness of mastitis treatments, and transferring of resistance determinants. The oxacillin resistance is mediated by PBP 2a protein, encoded by the mecA gene, which confers resistance to all β-lactam antibiotics, including cephalosporins and carbapenems. The mecA gene is part of a genomic island called staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), which may also include other resistance genes. Oxacillin resistance was studied in 170 Staphylococcus isolated from subclinical mastitis, 79 S. aureus and 91 coagulase-negative staphylococci (CNS). The bacterial strains were isolated from six Brazilian states; four from Minas Gerais, 27 from Paraná, three from Pernambuco, eleven from Rio Grande do Sul, 56 from Santa Catarina and 69 from São Paulo. The susceptibility profile to ten antimicrobial agents used in the veterinary practice was determined by E-TEST® method. Phenotypic characterization of oxacillin resistance was performed by disk diffusion test with oxacillin and cefoxitin, agar dilution test with oxacillin and E-TEST® with oxacillin. All strains were screened by PCR to detect mecA gene using two pairs of primers amplifying different regions of the gene. The strains with oxacillin resistance phenotype were identified by sequencing a 536 bp fragment of 16S rRNA gene. This group was also evaluated for the presence of the gene mecC and blaZ, which encodes for the enzyme β-lactamase. The PCR products were sequenced to confirm the results. Molecular analysis of mecA gene was carried out by the typing of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) and the mecA-positive strains by macrorestriction of chromosomal DNA followed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). With the exception of penicillin and oxacillin, more than 86% of the strains presented susceptibility to cephalothin, gentamicin, clindamycin, erythromycin, enrofloxacin, sulfonamide, trimethoprim-sulfamethoxazole and tetracycline. All S. aureus strains were sensitive to oxacillin, while 29.7% of the CNS strains were resistant. The CNS were more resistant than S. aureus to cephalothin and erythromycin (p ≤ 0.01) and gentamicin, clindamycin, and tetracycline (p ≤ 0.05). The
agar diffusion test with cefoxitin disc showed higher sensitivity and specificity for the presence of the mecA gene. Considering the total strains studied, 31 CNS were phenotypically resistant to oxacillin in at least one of the tests, and only in ten CNS was detected the mecA gene. mecA-positives bacteria were identified as Staphylococcus epidermidis and classified into three pulsotypes (A, B and C) and four subtypes (A1, B1, B2 and B3). Among strains with oxacillin resistance phenotype, 16 were positive for blaZ gene, seven mecA-negatives and nine mecA-positive strains. Two of the oxacillin resistant strains amplified mecA-like gene of S. sciuri and none amplified mecC. Three SCCmec types were found, types I, IV and V. The results suggest that S. epidermidis can be a reservoir of oxacillin resistance to other species of staphylococci, both of human and animals. Studies that generate information about the molecular and phenotypic profile of antimicrobial resistance in staphylococcal species should be performed for controlling the spread of resistance and selection of appropriate therapeutic measures.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:hermes.cpd.ufjf.br:ufjf/816 |
| Date | 12 February 2014 |
| Creators | Santos, Fernanda Fernandes dos |
| Contributors | Machado, Marco Antonio, Brito, Maria Aparecida Vasconcelos Paiva, Paiva, Aline Dias, Lange, Carla Christine |
| Publisher | Universidade Federal de Juiz de Fora, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia, UFJF, Brasil, ICB – Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFJF, instname:Universidade Federal de Juiz de Fora, instacron:UFJF |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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