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Previous issue date: 2016-08-12 / FACEPE / O câncer é uma doença que representa um grave problema de saúde pública em todas as nações do mundo, sua incidência tem aumentado devido à crescente exposição da população a fatores de risco e ao aumento da expectativa de vida. A quimioterapia é a modalidade de tratamento mais empregada, pois possui a vantagem de atuar de forma sistêmica. No entanto, sabe-se que a grande maioria dos agentes quimioterápicos não age exclusivamente em células tumorais, podendo levar a diferentes graus de toxicidade em células normais. Ademais, células neoplásicas adquirem a capacidade de se tornarem resistentes a vários quimioterápicos diminuindo a eficácia do tratamento, a qualidade de vida e a perspectiva de cura dos pacientes. Nesse sentido, a presente proposta teve como finalidade a elucidação do mecanismo de ação de um novo agente antineoplásico por meio da análise proteômica na linhagem leucêmica resistente, HL60/MX1. As oxazolidinas e seus derivados já possuem diversas atividades descritas na literatura entre elas potencial ação antineoplásica. No estudo foi utilizado o derivado oxazolidinico LPSF-NB-3 que em um estudo anterior do grupo apresentou ação na referida linhagem. Inicialmente buscou-se confirmar a toxicidade do novo derivado em células saudáveis e na linhagem resistente. LPSF-NB-3 não foi tóxico em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na maior dose testada (100 μM) e apresentou valor de IC₅₀ de 56,33 μM na linhagem HL60/MX1. Diante dos resultados, foi realizada cultura celular para elucidação do mecanismo de ação pela análise proteômica. Após 48 horas de tratamento, foi realizada a extração de proteínas com tampão de lise celular e inibidor de proteases e a amostra foi submetida à abordagem proteômica gel free e label free utilizando cromatografia bidimensional acoplada à espectrometria de massas (nanoUPLC). Após o processamento dos dados brutos utilizando o programa Protein Lynks Global Sever, foi possível identificar um total de 2.650 proteínas. Em nossa análise somente foram consideradas as proteínas identificadas em todas as replicatas experimentais, bem como as que apresentaram modulação de mais que duas vezes. Com isso, após utilizarmos este filtro, 634 proteínas, de fato, foram analisadas com a ferramenta Expression ᴱ. Dentro do universo de proteínas consideradas para a análise quantitativa com os critérios estabelecidos, 262 estavam diferencialmente expressas, sendo 146 com expressão aumentada e 116 com expressão diminuída na amostra tratada com o derivado quando comparadas com o controle. As proteínas identificadas foram analisadas no programa MetaCore™ para que as principais funções e vias de sinalização alteradas pudessem ser identificadas. Dentre os principais processos biológicos diferencialmente expressos, destacam-se processos envolvendo regulação do citoesqueleto, dano ao DNA, transdução de sinais celulares e processos envolvendo crescimento celular e sua manutenção. Duas vias moduladas receberam destaque em nossa análise, são elas: a via de sinalização AKT e vias do sistema imune. Essa última pôde ser validada pela técnica de ELISA que evidenciou a capacidade do derivado em diminuir a expressão de IFN- γ de forma significativa (p <0.01) nas doses de 50 e 100 μM e de outras citocinas inflamatórias importantes no contexto tumoral, indicando assim seu provável mecanismo de ação. / Cancer represents a serious public health problem in every nation of the world. Its incidence has increased due growing population exposure to risk factors and life expectancy. Chemotherapy is more used as treatment because it acts systemically. However, it is known that most chemotherapeutic agents don‘t kill only tumor cells, leading to different degrees of normal cells toxicity. In addition, neoplastic cells can become resistant to chemotherapy reducing treatment success, quality of life and chance of cure. Therefore, this proposal aimed to elucidate the mechanism of action of a new antineoplastic agent in resistant leukemic strain (HL60 / MX1) by proteomic analysis. Oxazolidines and their derivatives have several activities described on literature including antineoplastic potential. LPSF-NB-3 is an oxazolidine derivative that presented antineoplastic activity on HL-60 / MX1 cells in an earlier study. Initially we aimed to confirm toxicity in healthy cells and in this resistant strain. LPSF-NB-3 was non-toxic in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) at the highest tested dose (100 μM) and presented IC50 value of 56.33 μM in HL60 / MX1 strain. Cell culture was performed to elucidate the mechanism of action by proteomic analysis. After 48 hours of treatment, a protein extraction with cellular lysis buffer and protease inhibitor was performed and sample was applied to proteomic approach gel free and label free using two-dimensional chromatography coupled to mass spectrometry (nanoUPLC). Protein Lynks Global Sever program processed data and identified 2,650 proteins. In this analysis were only considered proteins identified in all experimental replicates, such as those modulated more than two times. After using this filter, 634 proteins were analyzed by Expression E tool. Within the universe of proteins considered by quantitative analysis with the established criteria, 262 were differentially expressed, being 146 increased and 116 decreased in the sample treated with the derivative when compared to control. The identified proteins were analyzed by MetaCore™ to identify changes in main functions and signaling pathways. Among the biological processes differentially expressed are those involving cytoskeletal regulation, DNA damage, cell signal transduction and cell growth and its maintenance. Two modulated pathways were highlighted in our analysis: an AKT signaling pathway and immune system pathways. The last one was validated by ELISA showing derivative capacity to reduce important inflammatory cytokines in tumor context IFN-g decreasing was statistically significant (P <0.01) at 50 and 100 μM doses] indicating its probable mechanism of action.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/25043 |
| Date | 12 August 2016 |
| Creators | CARVALHO, Lidiane Vasconcelos do Nascimento |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/7233767393471644, RÊGO, Moacyr Jesus Barreto de Melo, PAIVA, Patrícia Maria Guedes, PITTA, Maira Galdino da Rocha |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Inovacao Terapeutica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
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