Ein Schlüsselfeld der gegenwärtigen Biomaterialforschung ist die Modifizierung von Oberflächen mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) oder Molekülen, die bestimmte Funktionen nachahmen.
Trotz einer Reihe positiver Ergebnisse in vitro und in vivo ist es mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Immobilisierungsmethoden nicht möglich, unterschiedliche Komponenten in einem Prozessschritt zu immobilisieren, definierte Freisetzungscharakteristika für gleiche und/oder unterschiedliche Moleküle zu realisieren und die Beschichtung der Oberflächen nach Sterilisation der Implantate vorzunehmen, um empfindliche bioaktive Substanzen, wie Proteine, vor Schädigung zu bewahren.
An diesem Punkt setzt die vorliegende Arbeit mit dem Ziel an, ein nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem für Titanwerkstoffe zu entwickeln. Es wird zunächst am Beispiel eines Peptids mit der Aminosäuresequenz Arginin–Glyzin–Asparaginsäure (RGD) nachgewiesen, dass an der Grenzfläche Passivschicht/Elektrolyt von Titanwerkstoffen vorliegende Moleküle in durch anodische Polarisation verdickte Oxidschichten partiell eingebaut werden können und dabei ihre Funktionalität erhalten bleibt.
Diese Immobilisierungsmethode wird zum Immobilisierungssystem erweitert, indem Nukleinsäureeinzelstränge mit der beschriebenen Methode als Ankerstränge (AS) in anodisch formierte Oxidschichten fixiert und in einem zweiten Prozessschritt mit komplementären Gegensträngen (GS) hybridisiert werden.
In der Arbeit wird gezeigt, dass das Peptid in einem weiten Parameterbereich der elektrochemischen Bedingungen immobilisiert werden kann. Demgegenüber führen im Falle des nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystems die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Photoaktivität der Oxidschicht sowie mehrfache Trocknungen und Wiederbenetzungen zu einer Schädigung gebundener AS bis hin zu einem vollständigen Verlust der Hybridisierbarkeit. Durch Zugabe von Ethanol in hoher Konzentration während des Immobilisierungsschritts, Arbeit unter Lichtausschluss sowie Vermeidung mehrerer Trocknungen und Wiederbenetzungen können die Nebenwirkungen soweit eingeschränkt werden, dass alle immobilisierten AS hybridisierbar sind.
Nach dessen Etablierung im Rahmen dieser Arbeit ist es in nachfolgenden Projekten möglich, das nukleinsäurebasierte Immboilisierungssystem zu einem modularen, nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystem zu erweitern, um die eingangs beschriebenen Grenzen etablierter Methoden zu umgehen. Dazu müssen im zweiten Prozessschritt Konjugate aus GS und bioaktiven Molekülen, wie z. B. Peptide oder Wachstumsfaktoren, eingesetzt werden. Weiterhin können durch die Nutzung verschiedener Längen und Basensequenzen die Hybridstabilität und damit die Freisetzungskinetik beeinflusst werden.:1 Einleitung 1
2 Grundlagen 7
2.1 Titanbasislegierungen als Implantatwerkstoff 7
2.2 Biochemische Modifizierung von Titanoberflächen 22
2.3 Modulares Immobilisierungssystem 38
3 Materialien und Methoden 45
3.1 Werkstoffe 45
3.2 Biologisch aktive Moleküle 46
3.3 Elektrochemische Versuchsanordnung 51
3.4 Untersuchungsmethoden 52
4 Experimentelle Ergebnisse 69
4.1 Immobilisierung des RGD-Peptids 69
4.2 Nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem 118
5 Diskussion der Ergebnisse 143
5.1 Wechselwirkung zwischen Molekülen und Oberfläche 143
5.2 Fixierung adsorbierter Moleküle 155
6 Zusammenfassung und Ausblick 169
Literaturverzeichnis 175
Anhänge
A Kodierung der Aminosäuren 209
B XPS-elementspektren ausgewählter Zustände 211
c Allgemeine Arbeitsvorschriften 215
D Geräte 221 / Surface functionalization with bioactive molecules is a main field in current biomaterial research. However, in vitro and in vivo results are heterogeneous. This may be at least partially attributed to the limits of the applied immobilization methods. With established immobilization methods possibilities are limited to immobilize different molecules in one step, to implement defined release kinetics for similar and/or different substances, or to carry out the immobilization after sterilization of the implant to save sensitive molecules from damage.
Therefore in this thesis a nucleic acid based immobilization system for bioactive molecules is developed for titanium based materials. Using a peptide with the amino acid sequence arginine–glycine–aspartic acid (RGD) it is demonstrated at first, that small molecules, being present at the interface electrolyte/passive layer, can be immobilized by their partial incorporation in anodically formed oxide layers. The immobilization can be carried out in a wide range of electrochemical parameters and the peptide preserves its biological function under all conditions.
This immobilization method is enhanced by utilizing single-stranded nucleic acids as anchor strands (AS), which can be hybridized by complementary strands (CS) in a second step. Contrary to the peptide, bound AS are damaged by the formation of reactive oxygen species during anodic polarization of the substrate, the photoyctivity of the titanium oxide layer and multiple drying and wetting cycles. These side effects must be constrained by adding ethanol in a high concentration to the electrolyte during the immobilization procedure, excluding light during preparation and avoiding multiple drying and wetting cycles. Applying these conutermeasures, a 100% hybridization of immobilized AS can be achieved.
After establishing the nucleic acid based immobilization system it can be developed further to a modular, nucleic acid based immobilization system to overcome limitations of established immobilization methods. At first, conjugates of CS and bioactive molecules, such as peptides or growth factors, should be used in the hybridization step for a true functionalization of the surface. Furthermore, hybrid stability and thus release kinetics can be adjusted by using CS of different length and base sequences.:1 Einleitung 1
2 Grundlagen 7
2.1 Titanbasislegierungen als Implantatwerkstoff 7
2.2 Biochemische Modifizierung von Titanoberflächen 22
2.3 Modulares Immobilisierungssystem 38
3 Materialien und Methoden 45
3.1 Werkstoffe 45
3.2 Biologisch aktive Moleküle 46
3.3 Elektrochemische Versuchsanordnung 51
3.4 Untersuchungsmethoden 52
4 Experimentelle Ergebnisse 69
4.1 Immobilisierung des RGD-Peptids 69
4.2 Nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem 118
5 Diskussion der Ergebnisse 143
5.1 Wechselwirkung zwischen Molekülen und Oberfläche 143
5.2 Fixierung adsorbierter Moleküle 155
6 Zusammenfassung und Ausblick 169
Literaturverzeichnis 175
Anhänge
A Kodierung der Aminosäuren 209
B XPS-elementspektren ausgewählter Zustände 211
c Allgemeine Arbeitsvorschriften 215
D Geräte 221
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:25909 |
| Date | 09 March 2011 |
| Creators | Beutner, René |
| Contributors | Worch, Hartmut, Müller, Bert, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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