Le 2-éthylhexyl nitrate (2-EHN) est incorporé en quantité significative au gazole afin d'augmenter son indice de cétane. Ce composé est produit à raison de 100 000 tonnes par an, principalement en France. Les risques liés à son utilisation sont cependant mal connus car en cas de contamination de l'environnement, on ne sait pas s'il est biodégradable. Cette étude avait pour but (i) d'évaluer la capacité de biodégradation du 2-EHN par des bactéries sélectionnées, (ii) d'élucider la voie de dégradation, et (iii) d'identifier les enzymes impliquées. Les tests de biodégradation prenant en compte le caractère toxique et hydrophobe du substrat on été mis au point dans un premier temps. A l'aide de ces tests qui reposent sur la mise en oeuvre de cultures biphasiques, nous avons montré que plusieurs souches de Mycobacterium austroafricanum étaient capables de dégrader le 2-EHN. La souche la plus performante (IFP 2173), résistant à des concentrations de 2-EHN de 6 g.L-1, a été choisie pour étudier la voie de dégradation. Sur la base de bilans carbone et d'analyse du milieu de culture par chromatographie gazeuse (CG), j'ai découvert que la dégradation du 2-EHN était incomplète et donnait lieu à l'accumulation d'un métabolite. Ce métabolite a été identifié comme étant la β-méthyl-γ-butyrolactone par des analyses de CG-MS et LC-MS/MS. La structure de cette lactone indiquait que le 2-EHN était dégradé selon une voie enzymatique impliquant l'hydroxylation du groupement méthyle de la chaîne carbonée principale, son oxydation en aldéhyde et acide, et enfin un cycle de β-oxydation. <br>Dans un deuxième temps, les enzymes impliquées dans la voie de dégradation du 2-EHN ont été recherchées par une approche protéomique. Des analyses par électrophorèse bidimensionnelle ont mis en évidence qu'en présence de 2-EHN, la souche IFP 2173 déclenche la synthèse d'une panoplie d'enzymes spécialisées dans le métabolisme des acides gras, comme les enzymes de la β-oxydation, des alcool et aldéhyde déshydrogénases. Une analyse exhaustive du protéome de la souche IFP 2173 a permis d'identifier par LC-MS/MS plus de 200 protéines induites sur 2-EHN, notamment un cytochrome P450 de type alcane monooxygénase (CYP153). En outre, j'ai également identifié et cloné les gènes codant deux alcanes hydroxylases transmembranaires de types AlkB, qui n'ont pas été détectées par l'approche protéomique. Ainsi, la souche IFP 2173 possède trois alcane hydroxylases susceptibles de catalyser l'attaque initiale du 2-EHN. Pour déterminer laquelle de ces trois monooxygénases était responsable de cette réaction, leur gène respectif a été cloné dans des plasmides conçus pour l'expression soit chez E. coli, soit chez M. smegmatis mc². Nos résultats préliminaires montrent que dans certains cas les protéines recombinantes sont bien synthétisées. Ces constructions seront employées pour étudier l'activité des trois hydroxylases de IFP 2173 vis-à-vis des alcanes et du 2-EHN en particulier.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00334974 |
| Date | 07 October 2008 |
| Creators | Nicolau, Elodie |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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