Le remodelage ventriculaire gauche (VG) en post-infarctus du myocarde (IDM) est associé à une augmentation du risque d’insuffisance cardiaque et de décès, mais il demeure difficile à prédire en pratique clinique.L’objectif principal de ma thèse était la recherche de biomarqueurs circulants du remodelage VG par l’approche protéine candidate et par protéomique différentielle dans la population REVE-2.Par l’approche protéine candidate, nous avons confirmé que le peptide natriurétique detype B (BNP) était un puissant facteur prédictif du remodelage VG en post-IDM. La métalloprotéase matricielle-8 (MMP-8), la MMP-9, l’hepatocyte growth factor (HGF), la Créactive protéine (CRP), la troponine I ont également fait la preuve de leur association.Par l’approche protéomique différentielle, en électrophorèse 2D différentielle en fluorescence (2D-DIGE), la clusterine a été identifiée comme biomarqueur potentiel,positivement associée au remodelage VG, nécessitant toutefois des travaux de confirmation.Par SELDI TOF MS, nous avons sélectionné 26 pics définis par leur rapport m/z, commebiomarqueurs potentiels du remodelage VG, dont 12 ont pu être identifiés et devrontdésormais être validés : le pic de m/z 2777 a été identifié comme le peptide N-terminal issu del’albumine après clivage par la pepsine. Les autres pics correspondraient à des fragments protéolytiques de protéines que sont le fibrinogène, le complément C3, C4 et C1q.La découverte de nouveaux biomarqueurs du remodelage VG devrait permettre d’améliorer la stratification du risque en post-IDM afin d’identifier les patients devant bénéficier d’un suivi plus rapproché et peut-être d’une prise en charge thérapeutique plus agressive / Left ventricular (LV) remodelling after myocardial infarction (MI) indicates a high risk of heart failure and death but remains difficult to predict in clinical practice. Biomarkers may help to refine risk stratification. The main purpose was to find circulating biomarkers of LV remodelling after MI, using two strategies : candidate protein approach and differential proteomic approach, working on a population with a clearly defined phenotype, the REVE-2 study, a prospective multicenter study including 246 patients with a first anterior Q-wave MI. Blood samples were obtained at hospital discharge, at 1 month, 3 months and 1 year. An echocardiography was performed at the same time except for the 1st month to assess LVR.By candidate protein approach, we confirmed that B-type natriuretic peptide (BNP) was a powerful predictor of LV remodelling after MI. Additional biomarkers, such as matrix metalloproteinase-8 (MMP-8), MMP-9, hepatocyte growth factor (HGF), C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I were found to be associated with LV remodelling, highlighting several pathways implicated in pathophysiology of LV remodelling. We have also shown that biomarkers in association (BNP and cardiac troponin I, BNP and MMP-8, BNP and MMP-9) could improve risk stratification in post-MI by selecting groups of patients at higher risk.As the ideal biomarker was still not identified, we applied a differential proteomic approach, with no a priori hypothesis, in order to characterize proteomic signature of LV remodelling. The use of a protein enrichment kit, consisting of a library of combinatorial hexapeptide ligands, compressed the protein concentration range of plasma and serum, through the simultaneous onestep dilution of high-abundance and concentration of lowabundance proteins. Protein enrichment kit prior to two-dimensional (2D) electrophoresis or SELDI TOF MS (surface-enhanced laser desorption–ionization time of flight) analysis enabled the detection of proteins that were not detected in native blood sample and the accessibility to proteolytic fragments obtained from major proteins. Clusterin (apolipoprotein J) was identified as a potential biomarker of LV remodelling by 2D-DIfferential Gel Electrophoresis (2D-DIGE). Clusterin was quantified by Western blot and ELISA and was found to be positively associated with LV remodelling. However, this association was not found with all LV remodelling parameters nor at each time during the year following MI, requiring further analysis. Differential proteomic approach by SELDI TOF MS selected 26 m/z peaks, as potential biomarkers of LV remodelling. Of them, 12 were identified by mass spectrometry. The 2777 m/z peak was identified directly from the ProteinChip array as being the N-terminal peptide (24–48 aa) generated from albumin by pepsin cleavage. Other peaks were identified after purification using chromatographic columns or liquid-phase isoelectric focusing : most of them were found to be proteolytic fragments of proteins like fibrinogen, C3, C4 and C1q complement. Identifications have now to be validated with specific techniques, usually by immmunoprecipitation and Western blot analysis.Finding new biomarkers of LV remodelling could help refine risk stratification and identify patients in whom more aggressive therapy and/or more frequent follow-up could be needed.

Le 2-éthylhexyl nitrate (2-EHN) est incorporé en quantité significative au gazole afin d'augmenter son indice de cétane. Ce composé est produit à raison de 100 000 tonnes par an, principalement en France. Les risques liés à son utilisation sont cependant mal connus car en cas de contamination de l'environnement, on ne sait pas s'il est biodégradable. Cette étude avait pour but (i) d'évaluer la capacité de biodégradation du 2-EHN par des bactéries sélectionnées, (ii) d'élucider la voie de dégradation, et (iii) d'identifier les enzymes impliquées. Les tests de biodégradation prenant en compte le caractère toxique et hydrophobe du substrat on été mis au point dans un premier temps. A l'aide de ces tests qui reposent sur la mise en oeuvre de cultures biphasiques, nous avons montré que plusieurs souches de Mycobacterium austroafricanum étaient capables de dégrader le 2-EHN. La souche la plus performante (IFP 2173), résistant à des concentrations de 2-EHN de 6 g.L-1, a été choisie pour étudier la voie de dégradation. Sur la base de bilans carbone et d'analyse du milieu de culture par chromatographie gazeuse (CG), j'ai découvert que la dégradation du 2-EHN était incomplète et donnait lieu à l'accumulation d'un métabolite. Ce métabolite a été identifié comme étant la β-méthyl-γ-butyrolactone par des analyses de CG-MS et LC-MS/MS. La structure de cette lactone indiquait que le 2-EHN était dégradé selon une voie enzymatique impliquant l'hydroxylation du groupement méthyle de la chaîne carbonée principale, son oxydation en aldéhyde et acide, et enfin un cycle de β-oxydation. <br>Dans un deuxième temps, les enzymes impliquées dans la voie de dégradation du 2-EHN ont été recherchées par une approche protéomique. Des analyses par électrophorèse bidimensionnelle ont mis en évidence qu'en présence de 2-EHN, la souche IFP 2173 déclenche la synthèse d'une panoplie d'enzymes spécialisées dans le métabolisme des acides gras, comme les enzymes de la β-oxydation, des alcool et aldéhyde déshydrogénases. Une analyse exhaustive du protéome de la souche IFP 2173 a permis d'identifier par LC-MS/MS plus de 200 protéines induites sur 2-EHN, notamment un cytochrome P450 de type alcane monooxygénase (CYP153). En outre, j'ai également identifié et cloné les gènes codant deux alcanes hydroxylases transmembranaires de types AlkB, qui n'ont pas été détectées par l'approche protéomique. Ainsi, la souche IFP 2173 possède trois alcane hydroxylases susceptibles de catalyser l'attaque initiale du 2-EHN. Pour déterminer laquelle de ces trois monooxygénases était responsable de cette réaction, leur gène respectif a été cloné dans des plasmides conçus pour l'expression soit chez E. coli, soit chez M. smegmatis mc². Nos résultats préliminaires montrent que dans certains cas les protéines recombinantes sont bien synthétisées. Ces constructions seront employées pour étudier l'activité des trois hydroxylases de IFP 2173 vis-à-vis des alcanes et du 2-EHN en particulier.

Une chute d'expression de l'enzyme L-isoaspartyl (D-aspartate) méthyltransferase (PIMT), connue pour réparer les protéines endommagées qui ont accumulé des résidus aspartates anormaux, a été démontrée chez le rat atteint de troubles neurologiques à caractère épileptique et dans les glioblastomes humains. Dans cette étude, un profil protéomique correspondant au phénomène de l'inhibition de la PIMT a été dressé, suite à la combinaison de la technologie de l'ARN interférent (siRNA) et de la technologie de micro-puces d'anticorps (microarray). Un changement du niveau d'expression de plusieurs protéines, sous leur forme totale et phosphorylée, dont Erk et phospho-Erk, RSK et phospho-RSK ainsi que Akt et phospho-Akt a été observé. Ces résultats ont été confirmés par immunodétection, conjointement à la validation d'une méthode d'enrichissement des phosphoprotéines par chromatographie d'affinité dont la matrice est composée de trioxyde d'aluminium. Par la suite, un traitement combinant l'inhibition de la PIMT et l'utilisation de l'acide valproïque, un médicament utilisé pour traiter l'épilepsie, a permis d'observé un effet sur l'activation d'Akt et de RSK ainsi que sur l'expression de RSK1. Paralèllement, le traitement à l'acide valproïque a permis d'observer que celui-ci stimule l'expression de la PIMT. L'identification de ces protéines et de leur régulation lors de l'inhibition de la PIMT, suggère que la PIMT contrôle des voies de signalisation dont celle des Mitogen-activated protein kinases (MAPK) passant par ERK ainsi que d'autres voies de signalisation impliquant Akt et RSK. Lors de l'inhibition de la PIMT de concert avec le traitement à l'acide valproïque, ces voies de signalisation semblent être davantage activées. Bien que ce travail de recherche ne procure que des résultats préliminaires sur le contrôle que peut avoir la PIMT sur les voies de signalisation intracellulaires, ceux-ci font place à des hypothèses intéressantes qui une fois confirmées, permettront de trouver des cibles pharmacologiques qui aideront à contrer le développement des neuropathologies telles que l'épilepsie et les tumeurs cérébrales. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : AKT, Cellules gliales cancéreuses, ERK, Immobilized metal-affinity chromatography, Phosphoprotéomique, PIMT, RSK.

L’analyse protéomique consiste à caractériser l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule, dans un état et à un temps donné (le protéome). L’analyse protéomique tend aujourd’hui à fournir des informations quantitatives, cependant, pour pouvoir générer des données fiables et sensibles, des optimisations méthodologiques doivent être apportées à chaque problématique biologique. L’objectif de cette thèse a été d’adapter les stratégies protéomiques quantitatives existantes à diverses problématiques biologiques. Ce travail de thèse a ainsi contribué à apporter des résultats originaux concernant l’étude de désordres métaboliques. Il a également permis la mise au point d’une méthode de suivi du statut reproducteur de la tortue Luth. Finalement, il a permis d’évaluer la réponse d’une lignée cellulaire hépatique à une intoxication chronique à l’acide valproique. Ces données alimenteront des algorithmes de prédiction de toxicité hépatique chronique au travers du consortium NOTOX (EU). / Proteomics consists in the characterization of all the proteins expressed in a physiological state and at a given time (the proteome). Today, proteomics tends to bring quantitative information. However, in order to generate reliable, sensitive and robust data, whatever the biological question, methodological improvements need to be done. The aim of this PhD thesis was to apply and adapt quantitative proteomics strategies to specific biological issues as there is no universal quantifying method. This PhD thesis contributed to bringing original results concerning the study of metabolic disorders. It has also contributed to setting-up a targeted approach in order to quantify the level of reproductive effort of Leatherback Turtles. Finally, this PhD thesis also contributed, through the consortium NOTOX (EU), to the evaluation of physiological answers of hepatic cell lines exposed to valproic acid. These data will be used in order to generate hepatotoxicity prediction algorithms.

L'extrême complexité des échantillons biologiques, la variabilité technique et la dépendance de la protéomique envers les banques protéiques empêchent l'analyse complète d'un protéome. Ce travail de thèse s'est focalisé sur le développement de méthodes pour la protéomique quantitative et la protéogénomique afin d'améliorer la caractérisation du protéome. Premièrement mon travail s'est centré sur le développement de méthodes quantitatives globales et ciblées. La mise en place de standards pour évaluer les performances de tous les niveaux de la stratégie analytique est aussi décrite. Ces méthodes ont été optimisées pour répondre à diverses questions biologiques. Mon doctorat s'est focalisé aussi autour de la protéogénomique. Une méthode d'analyse N-terminomique à haut débit a été développée et appliquée à l'étude de la mitochondrie humaine. Enfin, ce manuscrit présente une approche multi-omique visant à améliorer l'analyse du protéome avec la création de banques de données personnalisées . / The high intrinsic complexity of biological samples, the technical variability and the dependency of Bottom-up Proteomics to consensus protein sequence databases handicap the comprehensive analysis of an entire Proteome. My doctoral work was focused on method development in quantitative Proteomics and Proteogenomics in order to achieve a better proteome characterization. First, I focused on the development of global and targeted quantitative methods. The introduction and development of standard samples to assess the performances at any level of the analytical workflow is also described. These methods were applied to answer different biological questions. My PhD also focused on Proteogenomic method development. A high throughput N-terminomic analysis approach was developed and applied to the analysis of the human mitochondria. Finally, this manuscript presents a personalized multi-omics profiling strategy to improve the proteome analysis with the use of personalized databases.

Les stratégies de protéomique quantitative sans marquage sont très attractives dans le domaine de la recherche de biomarqueurs de pathologies. Cependant, elles requièrent une pleine maîtrise du schéma analytique et de sa répétabilité. Plus particulièrement, la préparation d’échantillons nécessite d’être suffisamment répétable pour ne pas impacter la qualité et la fiabilité des résultats. Les objectifs de cette thèse étaient de développer et d’optimiser des méthodes analytiques pour la protéomique quantitative, en particulier pour l’étape de préparation d’échantillons. Ainsi, un protocole innovant, simple, rapide et permettant l’analyse quantitative sans marquage d’un grand nombre d’échantillons avec une haute répétabilité a été développé et optimisé : le « Tube-Gel ». Par ailleurs, des préparations d’échantillons adaptées à différentes matrices biologiques pour la recherche de biomarqueurs ont été élaborées. Les méthodes mises au point et leur application ont permis de proposer des candidats biomarqueurs pour plusieurs pathologies : le glioblastome, les lymphomes B diffus à grandes cellules, et les complications survenant sur les greffons rénaux. / Label-free quantitative proteomics strategies are very attractive for diseases biomarkers researches. These approaches require the full control and the repeatability of the analytical workflow. In particular, the sample preparation has to be repeatable enough to ensure the quality and reliability of the results. Objectives of this work were to optimize and develop analytical methods for quantitative proteomics, with a special focus on the sample preparation step. Thus, an innovative, easy and fast protocol allowing the analysis of high sample numbers with high repeatability was developed and further optimized: the “Tube-Gel” protocol. Besides,sample preparations adapted to a variety of biological matrices were developed for the search of biomarkers. The developed methods and their application allowed the identification of potential biomarkers for a variety of diseases: glioblastoma, diffuse large B-cell lymphomas and renal transplants failures.

La maladie de Wilson est une atteinte génétique rare associée à des mutations du gène codant pour l’ATP7B, protéine de transport et d’excrétion du cuivre dans l’organisme, entrainant une accumulation toxique de cuivre dans l’organisme au niveau du foie et du cerveau. La difficulté d’établir une corrélation génotype-phénotype et la grande hétérogénéité du tableau clinique conduisent à des difficultés de prise en charge, notamment concernant le diagnostic et le suivi biologique et thérapeutique des patients. Dans cette étude, nous avons orienté nos recherches vers la découverte et l’évaluation de candidats biomarqueurs de diagnostics et de pronostics précoce de l’évolution vers des formes neurologiques de la maladie. L’accessibilité au modèle préclinique murin Atp7b-/- nous a permis d’engager une étude préclinique permettant dans un premier temps d’optimiser la partie expérimentale pour l’identification la plus fiable de nouveaux candidats biomarqueurs plasmatiques. Cette étude a permis l’identification d’un panel de 7 candidats biomarqueurs. Ces résultats nous ont permis de susciter l’intérêt des équipes médicales du Centre National de Référence Wilson (CNR) à Lyon et à Paris et d’engager une étroite collaboration pour débuter l’étude clinique. L’obtention d’une première cohorte d’échantillons plasmatiques provenant de patients atteints de la maladie de Wilson a permis d’évaluer la valeur translationnelle et clinique des candidats biomarqueurs identifiés et de débuter l’étude clinique d’exploration du protéome plasmatique de patients atteints de la maladie de Wilson. En outre, la compréhension des mécanismes moléculaires associés au développement de la physiopathologie hépatique a été étudiée et a permis de mettre en évidence de nouvelles cibles pour, à terme, améliorer la prise en charge clinique des patients atteints de la maladie de Wilson. / Wilson’s disease is a rare genetic disorder triggered by mutations in the ATP7B gene, which encodes a transport protein involved in copper transport and excretion, triggering toxic copper overloads in the liver and the brain. The lack of genotype-phenotype correlation and phenotype variability lead to clinical care difficulties, especially for the diagnosis and biological follow up of patients. In this study, we initiated the discovery and evaluation of biomarker candidates for the diagnosis of Wilson’s disease and for early prognosis towards neurological manifestation. With the availability of the Atp7b-/- mice model, we engaged a preclinical study leading to the qualification of a panel of 7 biomarker candidates. These results allowed us to raise the interest of the National Reference Center for Wilson’s disease (CNR) medical teams in Lyon and Paris and to engage a close collaboration to initiate clinical study. Using a first plasma cohort from Wilson’s disease patients, we assessed the translational and clinical value of the 7 biomarker candidates and engage discovery study on patients’ plasma samples. Furthermore, we also studied the molecular mechanisms involved in liver pathophysiology using the Atp7b-/- mice model using discovery proteomics. These investigations led to the identification of a new potential therapeutic target.

L’objectif de cette thèse était de développer et d’optimiser de nouvelles méthodologies et approches analytiques afin d’améliorer le potentiel de l’analyse protéomique pour les études biologiques.La première partie de ce travail est consacrée à la détermination massive et exacte de la position N-Terminale des protéines (N-Terminome). Pour cela, nous avons utilisé et développé une approche basée sur une dérivation N-Terminale au TMPP. Cette méthodologie de marquage de la position N-Terminale a permis d’aborder l’étude des clivages protéolytiques des protéines exportées par le parasite P. falciparum (pathogène de la malaria) dans le globule rouge.Afin de permettre une exploitation automatique à haut débit des données de MS/MS, nous avons élaboré une nouvelle méthodologie (dénommée dN-TOP). Celle-Ci repose sur l’utilisation de TMPP portant des isotopes stables et permet ainsi d’accéder à la détermination des positions N-Terminales pour des études de N-Terminome à large échelle.La seconde partie est dédiée aux développements de différentes stratégies analytiques de quantification, aussi bien au niveau peptidique qu’au niveau protéique, appliquées à une série de problématiques biologiques. Ces optimisations ont été réalisées dans le contexte de l’étude des complexes protéiques, du dosage de prion par SRM, de quantification des glycations d’anticorps monoclonaux thérapeutiques et de l’hémoglobine HbA2 pour la standardisation des méthodes de référence. / The objective of this Ph.D. thesis was to develop and optimize new methodologies and analytical approaches to improve the potential of the mass spectrometry based proteomics.The first part of this work focused on the development of the N-Termini proteomics. This topic was addressed with a specific N-Termini chemical derivatization based on TMPP. We have shown that our method allowed both specific N-Terminomics and classical proteomics studies in the same experiment.This N-Terminus methodology was applied to study the proteolytic cleavages of the exported proteins in P. falciparum, a parasite responsible for the malaria.In order to automatize the complex and tedious informatics processsing of the MS/SM data of ourTMPP based N-Terminomics method, we have introduced a new approach (named dN-TOP), based on the use of a stable isotope labeled TMPP which made now N-Terminome proteomics compatible with high throughput studies.The second part addresses quantitative aspects of proteomics. It describes the optimization of quantitative methods at the peptide level or at the protein level for five different proteomic studies in the context of protein complex subunits, targeted SRM based prion, quantification of monoclonal antibodies glycation and hemoglobin HbA2 for reference measurement methods standardization.

L’amélioration des performances de reproduction des poissons d’élevage nécessite de déterminer les facteurs intrinsèques et extrinsèques influençant la qualité des gamètes d’une part, et de définir des paramètres fiables permettant de prédire les performances de reproduction d’autre part. Notre objectif est donc de comprendre le déterminisme multifactoriel de la reproduction chez la perche commune, Perca fluviatilis. Quatre facteurs nutritionnels (type d’aliment et taux de rationnement distribués lors des phases d’induction et de vernalisation) et 3 facteurs populationnels (poids initial, origine géographique, niveau de domestication) ont été testés. Une différence de réponse entre les sexes a été observée. Le type d’aliment distribué en vernalisation et le poids initial ont modifié l’état général des femelles. Les mâles ont plutôt été sensibles aux taux de rationnement et à l’origine géographique. L’étude des performances de reproduction a montré que le taux de ponte était sous l’influence de l’interaction entre le type d’aliment distribué en induction et en vernalisation, tandis que l’origine géographique a modulé la date de ponte. La régulation des performances de reproduction est donc un mécanisme complexe sous l’influence simultanée de plusieurs facteurs. La seconde partie de ce travail concerne la recherche de marqueurs prédictifs de la qualité des ovules. Nous avons d’abord montré que peu de paramètres morpho-anatomiques des pontes ou ovules sont des prédicateurs fiables. Cependant, l’analyse protéomique a permis de mettre en évidence plusieurs protéines exprimées différemment selon la qualité des pontes, pouvant jouer le rôle de biomarqueurs de qualité des ovules / Improving fish reproduction in breeding conditions implies to understand intrinsic and extrinsic factors influencing gametes quality on the one hand and to define relevant parameters allowing the prediction of fish reproductive performance on the other hand. Our goal was thus to understand the multifactorial determinism of the common perch (Perca fluviatilis) reproduction. Four nutritional factors (type of food and rate of rationing used either during the induction or vernalization phases) and 3 populational factors (initial weight, geographic origin and domestication level of breeders) have been tested. Data show different responses between females and males. type of food during wintering phase and initial broodstock weigh modified female condition. Males have been sensitive to rationing during wintering phase as well as geographical origin. Data show also that spawning rate was under the influence of interaction between kind of food during wintering phase and induction whereas geographical origin modulated the spawning date. The regulation of the performance reproduction is also a complex mechanism influenced by several factors. The second part of this work consisted on the research of parameters potentially predictive of ova quality. Firstly, our work shows that morphometric parameters measured before the fertilization are poorly relevant to predict reproductive performance. However, the proteomic analysis of several spawn allowed us to highlight proteins differently expressed according to the spawn quality, such proteins could be ova quality biomarkers

Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d'infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l'intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d'un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l'interaction bactérie-peptide analysée. L'étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d'antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l'implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l'activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l'O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l'activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés.