Les protéines subissent progressivement des modifications post-traductionnelles non-enzymatiques au cours du vieillissement ou dans certains états pathologiques. La protéine-L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) est une enzyme qui reconnaît et répare les résidus anormaux L-isoaspartyl des protéines. Récemment, il a été démontré dans notre laboratoire que l'expression de la PIMT est stimulée par l'acide valproïque, un médicament anti-épileptique, via la voie de signalisation glycogènen-synthase-kinase-3 (GSK-3)/β-caténine. Dans cette étude, afin d'acquérir de nouvelles informations sur les voies de signalisation activées par l'acide valproïque régulant le niveau d'expression de la PIMT, les cellules d'astrocytome U-87 MG et de neuroblastome SH-SY5Y ont été traitées avec le médicament pour étudier l'implication de la voie de l 'extracellular signal-regulated kinase (ERK) dans l'induction de la PIMT. Les résultats montrent que l'acide valproïque augmente la phosphorylation de ERK1/2 sur Thr202/Tyr204 et sur Thr185/Tyrl87, respectivement. Des inhibiteurs pharmacologiques contre les kinases Src, c-Raf, MEK1/2 et ERK1/2 suppriment la phosphorylation de ERK1/2 stimulée par l'acide valproïque empêchant ainsi l'induction de la PIMT par le médicament. En outre, l'inhibition de MEK1/2 par U0126 bloque l'augmentation de la phosphorylation de RSK-1 au niveau des résidus Thr359/Ser363 et de la phosphorylation de GSK-3β sur la Ser9 ainsi que la stimulation de l'expression de RSK-1, de β-caténine et de la PIMT suite au traitement avec l'acide valproïque. L'abolition de RSK-1 par ARN interférant abroge l'induction de l'expression de RSK-1, de β-caténine et de la PIMT ainsi que l'augmentation des niveaux de phosphorylation de RSK-1 et de GSK-3β dépendants de l'acide valproïque. Ainsi, nos résultats démontrent que l'induction de l'expression de la PIMT par l'acide valproïque requiert l'activation de la voie de ERK1/2 incluant RSK-1 qui est responsable de l'inactivation de GSK-3 et en occurrence, la stabilisation de la β-caténine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine L-isoaspartyl méthyltransférase, Acide valproïque, Épilepsie, Voie de signalisation ERK1/2, RSK-1, GSK-3, β-caténine.

Une chute d'expression de l'enzyme L-isoaspartyl (D-aspartate) méthyltransferase (PIMT), connue pour réparer les protéines endommagées qui ont accumulé des résidus aspartates anormaux, a été démontrée chez le rat atteint de troubles neurologiques à caractère épileptique et dans les glioblastomes humains. Dans cette étude, un profil protéomique correspondant au phénomène de l'inhibition de la PIMT a été dressé, suite à la combinaison de la technologie de l'ARN interférent (siRNA) et de la technologie de micro-puces d'anticorps (microarray). Un changement du niveau d'expression de plusieurs protéines, sous leur forme totale et phosphorylée, dont Erk et phospho-Erk, RSK et phospho-RSK ainsi que Akt et phospho-Akt a été observé. Ces résultats ont été confirmés par immunodétection, conjointement à la validation d'une méthode d'enrichissement des phosphoprotéines par chromatographie d'affinité dont la matrice est composée de trioxyde d'aluminium. Par la suite, un traitement combinant l'inhibition de la PIMT et l'utilisation de l'acide valproïque, un médicament utilisé pour traiter l'épilepsie, a permis d'observé un effet sur l'activation d'Akt et de RSK ainsi que sur l'expression de RSK1. Paralèllement, le traitement à l'acide valproïque a permis d'observer que celui-ci stimule l'expression de la PIMT. L'identification de ces protéines et de leur régulation lors de l'inhibition de la PIMT, suggère que la PIMT contrôle des voies de signalisation dont celle des Mitogen-activated protein kinases (MAPK) passant par ERK ainsi que d'autres voies de signalisation impliquant Akt et RSK. Lors de l'inhibition de la PIMT de concert avec le traitement à l'acide valproïque, ces voies de signalisation semblent être davantage activées. Bien que ce travail de recherche ne procure que des résultats préliminaires sur le contrôle que peut avoir la PIMT sur les voies de signalisation intracellulaires, ceux-ci font place à des hypothèses intéressantes qui une fois confirmées, permettront de trouver des cibles pharmacologiques qui aideront à contrer le développement des neuropathologies telles que l'épilepsie et les tumeurs cérébrales. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : AKT, Cellules gliales cancéreuses, ERK, Immobilized metal-affinity chromatography, Phosphoprotéomique, PIMT, RSK.

La protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT) est une enzyme de réparation qui cible les protéines endommagées par l'accumulation de résidus L-isoaspartates anormaux. Les voies de signalisation qui contrôlent l'expression de la PIMT sont peu connues. D'autre part, la kinase mTOR est une protéine centrale pour les cellules. Elle contrôle la synthèse des protéines, le cycle cellulaire et l'intégration des voies de signalisation régulées par des facteurs de croissance et des nutriments. Or, nous démontrons dans cette étude que l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR. En utilisant des analyses par immunobuvardage de type Western et RT-PCR, nous montrons qu'une concentration physiologique (0.02 µM) et élevée (1 µM) de l'inhibiteur spécifique de mTOR, la rapamycine, inhibe (40% et 70%) l'expression de la PIMT sans modulation du niveau d'ARNm. D'un autre côté, l'expression de la PIMT diminue lorsqu'on prive les cellules en glutamine, une condition expérimentale connue pour inhiber mTOR. De plus, nous montrons que l'inhibition de l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR mais semble indépendante de la PI3K. Pour cela, nous avons employé des inhibiteurs de la PI3K (Wortmannin, LY294002), un analogue inactif (LY303511) qui n'agit pas sur la PI3K mais qui a été rapporté pour inhiber l'activité de mTOR, et un inhibiteur d'AKT. Enfin, nous avons utilisé un siRNA dirigé contre mTOR et montré que cela entraînait une diminution de 50% de l'expression de mTOR et de la PIMT. Ces résultats suggèrent fortement un mécanisme de régulation de la PIMT par mTOR. Sachant que mTOR est surexprimée dans certains cancers, l'inhibition de l'expression de la PIMT par l'inhibition de mTOR pourrait avoir une implication thérapeutique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT), Mammalian target of rapamycin (mTOR), Glioblastomes, Inhibiteurs des kinases, Voies de signalisation.

Avec le vieillissement, les protéines accumulent des dommages qui affectent leur structure et activité. La protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT) est impliquée dans la réparation de protéines endommagées au niveau de résidus aspartates. Bien que son mécanisme d'action soit connu, les voies de régulation qui influencent l'expression de la PIMT ne sont pas très bien établies. Dans cette étude, il a été observé que la protéine nommée glycogène synthase kinase 3 (GSK-3) est impliquée dans la régulation de la PIMT. En effet, le traitement de cellules gliales, devenues cancéreuses, par différents inhibiteurs connus de GSK-3, dont le lithium, a démontré une augmentation de l'expression de la PIMT. Dans la littérature, il a été rapporté que le lithium possède deux cibles principales dans la cellule: la voie de l'inositol et la protéine GSK-3. Cette dernière kinase est notamment contrôlée par la voie de Wnt. Or, le traitement des cellules avec le myo-inositol n'influence pas la PIMT, ce qui exclut la voie de l'inositol comme voie de régulation de la PIMT. Les résultats obtenus en présence de lithium suggèrent cependant une régulation de la PIMT par GSK-3, par l'intermédiaire de la voie de Wnt. Par ailleurs, un traitement des cellules avec différents inhibiteurs de protéines kinases, pouvant agir sur GSK-3 ne semble pas affecter l'expression de la PIMT. Cependant, un traitement des cellules avec un inhibiteur de la synthèse protéique, en présence de lithium, empêche l'augmentation de l'expression de la PIMT, ce qui suggère une régulation au niveau de sa synthèse. De plus, une analyse par RT-PCR démontre une modulation du niveau d'ARNm de la PIMT en présence de différents inhibiteurs de GSK-3. L'établissement de nouvelles voies de régulation pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans des maladies impliquant la PIMT, telle que dans l'épilepsie, l'Alzheimer et surtout dans les états maniaco-dépressifs. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : PIMT, GSK-3, Lithium, Cellules gliales cancéreuses.

Les protéines subissent des modifications post-traductionnelles tout au long de leur vieillissement mais aussi dans certains états pathologiques. Parmi ces modifications progressives des protéines, on retrouve notamment la formation des résidus aspartates isomérisés. La protéine L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) reconnaît et répare des résidus L-isoaspartates anormaux retrouvés dans des protéines. Il a été démontré que la PIMT joue un rôle crucial dans la formation et le maintien du système nerveux central. Ainsi, son fonctionnement s'est avéré important dans le désordre neurologique qu'est l'épilepsie, mais aussi potentiellement dans certaines maladies neurodégénératives comme l'Alzheimer. Notre laboratoire a déjà démontré que l'acide valproïque (VPA), un médicament anticonvulsant, induit l'expression de la PIMT via la voie de signalisation de ERK et également la voie de signalisation glycogènen-synthase-kinase-3 (GSK-3)/β-caténine. Le but de notre recherche a été d'identifier des nouvelles voies de signalisation qui contrôlent l'expression de la PIMT lorsque celle-ci est stimulée par le VPA. Comme modèle cellulaire nous avons utilisé des neuroblastomes SH-SY5Y qui ont été traités avec le VPA pour étudier l'implication de la voie de signalisation phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt dans l'induction de la PIMT. Nos résultats montrent que lors de l'induction de la PIMT par VPA, la protéine Akt est phosphorylée (Thr 308). De plus, lorsque la protéine PI3K est inhibée par des inhibiteurs pharmacologiques, wortmannin et le LY294002, la phosphorylation de Akt est bloquée et l'induction de la PIMT par VPA est arrêtée. L'inhibition de Akt par un siRNA spécifique produit le même effet. Également, lorsque la voie de signalisation PI3K/Akt est stimulée par le VPA on observe une phosphorylation de la protéine GSK-3 (Ser 21) qui est également observable lorsque les cellules sont traitées avec le lithium, un inhibiteur directe de GSK-3. Finalement, l'inhibition du facteur de transcription CREB avec un siRNA spécifique n'a pas affecté l'induction de la PIMT par VPA. En conclusion, notre étude a démontrée que j'induction de la PIMT par VPA est dépendante de la voie de signalisation PI3K/Akt. L'activation de cette voie de signalisation permet la phosphorylation et donc l'inhibition de la kinase GSK-3, mais l'induction de la PIMT par VPA est indépendante de facteur de transcription CREB. Ces résultats suggèrent plutôt que VPA en inhibant la kinase GSK-3 stabilise la β-caténine permettant ainsi l'expression de la PIMT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : PIMT, épilepsie, VPA, PI3K/Akt

La protéine L-isoaspartate méthyltransférase (PIMT) répare les protéines endommagées par la formation de résidus L-isoaspartates anormaux. Elle est majoritairement exprimée et active dans le cerveau. Or, la déficience en PIMT est largement associée à différentes maladies neurologiques tandis qu'une élévation de son niveau d'expression semble jouer un rôle protecteur. La PIMT est communément caractérisée comme une protéine monomérique du cytosol. Nous nous intéressons particulièrement aux mécanismes qui régulent son expression et son activité. Les dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) peuvent agir comme des messagers secondaires des voies de signalisation physiologiques, par contre, l'accumulation de ceux-ci peut causer des dommages oxydatifs et contribuer fortement à l'altération des processus cellulaires. En raison de divers facteurs, les cellules cérébrales peuvent être plus vulnérables face à une augmentation des DRO (stress oxydatif). Pourtant, il existe peu d'information concernant la régulation de la PIMT par les DRO dans le cerveau. Par ailleurs, les mitochondries sont les principales sources de DRO intracellulaires et leur association avec les désordres neurologiques est de plus en plus rapportée. Malgré le fait que la PIMT est aussi présente et active dans les mitochondries, aucune étude n'a encore examiné la régulation de son express ion dans ces organites. L'objectif de cette thèse était de démontrer que les DRO régulent l'expression de la PIMT. Dans un premier volet, nous avons investigué les effets des DRO sur l'express ion de la PIMT. Le phénylarsine oxyde (PAO) est une molécule dérivée de l'arsenic qui altère les protéines en oxydant les résidus cystéines vicinales (voisines sur la chaîne polypeptidique). En premier lieu, nous rapportons que la synthèse de la PIMT est rapidement stimulée par le traitement des cellules d'astrocytomes humains U87 avec le PAO. Nous avons aussi confirmé que l'augmentation de l'express ion de la PIMT par le PAO était dépendante de protéines possédant des cystéines vicinales. De manière importante, nous avons observé que l'augmentation de l'expression de la PIMT corrélait avec la formation de DRO induite par le PAO. De façon convaincante, nous avons pu démontrer que la formation des DRO et la stimulation de l'express ion de la PIMT par la PAO étaient bloquées par l'agent antioxydant N-acétylcystéine ainsi que par l'inhibition de la NADH/NADPH oxydase avec le chlorure de diphenyleneiodonium. De plus, nous avons montré que l'inhibition de l'express ion de la PIMT par siRNA accroissait significativement la formation des DRO induits par le PAO, indiquant que la PIMT agissait indirectement comme une protéine antioxydante. Dans un deuxième volet, nous avons caractérisé la PIMT associée aux mitochondries. Nous avons trouvé que la PIMT est exprimée sous une forme monomérique, dimérique et multimérique dans les fractions mitochondriales des cellules de neuroblastomes humains, les SH-SY5Y. L'analyse par électrophorèse bidimensionnelle a révélé deux isoformes spécifiques de la PIMT dans les fractions mitochondriales. Lorsque nous avons traité les cellules avec le carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), un agent découplant qui perturbe l'activité mitochondriale, l'expression et l'activité des monomères de PIMT ont diminué alors que l'expression et l'activité des multimères de PIMT ont été stimulées. De manière significative, l'assemblage des multimères de PIMT est le résultat de monomères de PIMT liés par des ponts disulfures car le traitement des multimères avec un agent réducteur comme le dithiothréitol les transforme en monomères de PIMT. L'acide ascorbique, un antioxydant, bloque significativement la formation des multimères de PIMT induite par le CCCP, validant que les DRO contribuent à la multimérisation de la PIMT. De plus, on a trouvé que le CCCP conduit à l'accumulation des résidus aspartates endommagés sélectivement au niveau des protéines avec un haut poids moléculaire. Il est particulièrement intéressant de noter que l'élévation de l'activité catalytique des multimères de la PIMT par le CCCP a été drastiquement inhibée par l'agent réducteur dithiothréitol. Ces résultats indiquent que les monomères de PIMT sont généralement inactifs après les traitements au CCCP et que l'activation des multimères de PIMT est essentiellement dépendante de la formation des liens disulfures entre monomères de PIMT. Cette thèse rapporte la régulation de la PIMT par les DRO et démontre que cette enzyme de réparation est une nouvelle protéine antioxydante. En plus, elle met en évidence que les DRO contribuent à la multimérisation et l'activation de la PIMT dans les mitochondries. Ces travaux de recherche mettent en lumière un nouveau champ d'étude sur la PIMT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : protéine L-isoaspartate méthyltransférase, dérivés réactifs de l’oxygène, mitochondries, liens disulfures, multimères