Doctorado en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El estudio de péptidos como moléculas terapéuticas ha generado gran interés en la industria farmacéutica debido a sus características de alta especificidad y actividad biológica y baja toxicidad. Igualmente, la exploración de nuevos blancos terapéuticos al interior de la célula es bastante atractiva ya que, posibilita la modulación e intervención de procesos intracelulares. En este contexto, disponer de un sistema de expresión recombinante de péptidos en un huésped como Escherichia coli, permitirá potenciar el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos, especialmente en el estudio de péptidos terapéuticos con actividad biológica intracelular y que requieran unión a péptidos de penetración celular como transportador, ya que el tamaño del péptido a sintetizar podría no ser adecuado para su síntesis química en forma eficiente y sustentable.
El trabajo realizado consiste en el diseño de un sistema de expresión bacteriana de péptidos potencialmente terapéuticos, con blanco intracelular y que utilicen al péptido de penetración celular Penetratin como transportador, que permita la producción de diversos péptidos con el fin de estudiar su potencial terapéutico. El sistema fue evaluado mediante la expresión de los péptidos p53pAnt y PNC27, los cuales han mostrado tener actividad biológica antitumoral in vitro.
Se diseñó el vector pET31HT que permite la expresión de los péptidos fusionados a la proteína cetoesteroide isomerasa (KSI) en una forma tal que puedan ser posteriormente separados y obtenidos con su secuencia original mediante corte con Trombina. Utilizando técnicas de ingeniería genética se construyó el vector de expresión diseñado. Para la implementación del sistema, se clonó las secuencias nucleotídicas correspondientes a los péptidos p53pAnt y PNC27 en el vector pET31HT. Se logró la producción de los péptidos fusionados en células transformadas con las construcciones pET31HT-p53pAnt y pET31HT-PNC27. La expresión se obtuvo en forma de cuerpos de inclusión y se determinó que los niveles de expresión de proteína recombinante se mantienen constantes y alrededor del 20% del peso seco celular, para distintas condiciones de inducción.
Los péptidos fusionados fueron purificados desde la fracción de proteína insoluble por cromatografía de afinidad en condiciones desnaturantes. Mediante una estrategia que incluye precipitación por dilución y solubilización de las muestras en un buffer específico, se logró la separación del péptido p53pAnt de la proteína KSI en un proceso de proteólisis altamente eficiente. Sin embargo, no se logró separar al péptido PNC27 desde la proteína de fusión probablemente debido a la rigidez impuesta por sus aminoácidos iniciales a la región de reconocimiento de la proteasa. El péptido p53pAnt fue purificado desde el producto de digestión, según la estrategia diseñada, obteniéndose un péptido altamente puro.
Las características del sistema, en conjunto con el proceso de purificación desarrollado, permiten la síntesis biológica de péptidos con una productividad mayor a 30 mg/g de peso seco celular y con una pureza de al menos un 95%. Con esto, el sistema diseñado es apropiado para su uso en la producción de péptidos para investigación científica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/115378 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Rodríguez Gallardo, Vida |
| Contributors | Andrews Farrow, Bárbara, Facultad de Ciencias Físicas y Matémáticas, Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, Olivera Nappa, Álvaro, Salazar Aguirre, María Oriana, Israel Jacard, Yedy |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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