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Previous issue date: 2009-11-18 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermal-dimorphic fungus, the causative agent of
Paracoccidioidomycosis (PCM), an important endemic mycosis in Latin America. A protein
species preferentially expressed in yeast cells with a molecular mass of 80kDa and isoeletric
point (pI) of 7.79 was isolated from the proteome of P. brasiliensis and characterized as an
aconitase (E.C. 4.2.1.3). Aconitase is an enzyme that catalyzes the isomerization of citrate to
isocitrate in both the Krebs cycle (KC) and the glyoxylate cycle (GC). We report the cloning and
characterization of the cDNA encoding the aconitase of P. brasiliensis (PbACO). The cDNA
showed a 2337 bp open reading frame (ORF) and encoded a predicted protein with 779 amino
acids. A polyclonal antibody against the purified recombinant PbACO was obtained in order to
analyze the subcellular localization of the molecule in P. brasiliensis. The protein is present in
the extracellular fluid, cell wall, mitochondria, cytosol and peroxisomes of yeast cells as
demonstrated by western blot and immunocytochemistry analysis. The expression analysis of the
Pbaco gene was performed through quantitative real time RT-PCR and results demonstrated
increasing expression during differentiation from mycelium to yeast cells. Real time RT-PCR
assays was also used to evaluate the Pbaco expression when the fungus grows on media with
acetate and ethanol as sole carbon sources and in different iron levels. The results demonstrated
that Pbaco transcript is over expressed in acetate and ethanol as sole carbon sources and in highiron
conditions. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente causador de uma importante micose
sistêmica na América Latina, a paracoccidioidomicose (PCM). Uma proteína apresentando massa
molecular de 80kDa e ponto isoelétrico (pI) de 7,79, preferencialmente expressa em células
leveduriformes, foi isolada do proteoma de P. brasiliensis e caracterizada como uma aconitase
(EC 4.2.1.3). Aconitase é uma enzima que catalisa a isomerização do citrato em isocitrato tanto
no ciclo de Krebs (CK) quanto no ciclo glioxalato (CG). No presente estudo reportamos a
clonagem e caracterização do cDNA da aconitase de P. brasiliensis (PbACO). O cDNA
apresentou um quadro aberto de leitura (ORF) com 2337 pares de bases, codificando uma predita
proteína com 779 resíduos de aminoácidos. Objetivando a localização da aconitase de P.
brasiliensis foi produzida e purificada uma proteína recombinante a qual foi utilizada para a
produção de um anticorpo policlonal anti-PbACO. A proteína foi localizada no fluído
extracelular, parede celular, mitocôndria, citosol e nos peroxissomos de células leveduriformes,
como demonstrado por ensaios de Western blotting e por imunocitoquímica. A análise da
expressão do gene Pbaco foi realizada através RT-PCR em tempo real e os resultados
demonstraram um aumento da expressão durante a diferenciação celular de micélio para
levedura. A expressão Pbaco também foi avaliada quando o fungo é cultivado em meios de
cultura contendo acetato e etanol como única fonte de carbono bem como em diferentes
concentrações de ferro. Os resultados demonstraram que o transcrito de Pbaco é mais expresso
em acetato e etanol como única fonte de carbono e em altas concentrações de ferro.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tde/1018 |
| Date | 18 November 2009 |
| Creators | BRITO, Wesley de Almeida |
| Contributors | SOARES, Célia Maria de Almeida |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Doutorado em Biologia, UFG, BR, Ciencias Biologicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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