Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Wesley de Almeida Brito.pdf: 6161747 bytes, checksum: 6249a08f73180f831c2df168246efa67 (MD5) Previous issue date: 2009-11-18 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermal-dimorphic fungus, the causative agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), an important endemic mycosis in Latin America. A protein species preferentially expressed in yeast cells with a molecular mass of 80kDa and isoeletric point (pI) of 7.79 was isolated from the proteome of P. brasiliensis and characterized as an aconitase (E.C. 4.2.1.3). Aconitase is an enzyme that catalyzes the isomerization of citrate to isocitrate in both the Krebs cycle (KC) and the glyoxylate cycle (GC). We report the cloning and characterization of the cDNA encoding the aconitase of P. brasiliensis (PbACO). The cDNA showed a 2337 bp open reading frame (ORF) and encoded a predicted protein with 779 amino acids. A polyclonal antibody against the purified recombinant PbACO was obtained in order to analyze the subcellular localization of the molecule in P. brasiliensis. The protein is present in the extracellular fluid, cell wall, mitochondria, cytosol and peroxisomes of yeast cells as demonstrated by western blot and immunocytochemistry analysis. The expression analysis of the Pbaco gene was performed through quantitative real time RT-PCR and results demonstrated increasing expression during differentiation from mycelium to yeast cells. Real time RT-PCR assays was also used to evaluate the Pbaco expression when the fungus grows on media with acetate and ethanol as sole carbon sources and in different iron levels. The results demonstrated that Pbaco transcript is over expressed in acetate and ethanol as sole carbon sources and in highiron conditions. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente causador de uma importante micose sistêmica na América Latina, a paracoccidioidomicose (PCM). Uma proteína apresentando massa molecular de 80kDa e ponto isoelétrico (pI) de 7,79, preferencialmente expressa em células leveduriformes, foi isolada do proteoma de P. brasiliensis e caracterizada como uma aconitase (EC 4.2.1.3). Aconitase é uma enzima que catalisa a isomerização do citrato em isocitrato tanto no ciclo de Krebs (CK) quanto no ciclo glioxalato (CG). No presente estudo reportamos a clonagem e caracterização do cDNA da aconitase de P. brasiliensis (PbACO). O cDNA apresentou um quadro aberto de leitura (ORF) com 2337 pares de bases, codificando uma predita proteína com 779 resíduos de aminoácidos. Objetivando a localização da aconitase de P. brasiliensis foi produzida e purificada uma proteína recombinante a qual foi utilizada para a produção de um anticorpo policlonal anti-PbACO. A proteína foi localizada no fluído extracelular, parede celular, mitocôndria, citosol e nos peroxissomos de células leveduriformes, como demonstrado por ensaios de Western blotting e por imunocitoquímica. A análise da expressão do gene Pbaco foi realizada através RT-PCR em tempo real e os resultados demonstraram um aumento da expressão durante a diferenciação celular de micélio para levedura. A expressão Pbaco também foi avaliada quando o fungo é cultivado em meios de cultura contendo acetato e etanol como única fonte de carbono bem como em diferentes concentrações de ferro. Os resultados demonstraram que o transcrito de Pbaco é mais expresso em acetato e etanol como única fonte de carbono e em altas concentrações de ferro.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert part 1 Benedito.pdf: 5001631 bytes, checksum: 7d51091e361c98586e384be80ebe9178 (MD5) Previous issue date: 2009-05-11 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis causative of Paracoccidioidomycosis (PCM), a pulmonary mycose acquired by inhalation of fungal airborne propagules, which may disseminate to several organs and tissues leading to a severe form of the disease. Adhesion and invasion to host cells are essential steps involved in the internalization and dissemination of pathogens. Inside host, P. brasiliensis use the glyoxylate cycle for intracellular survival. Here, we provide evidence that malate synthase of P. brasiliensis (PbMLS) is localized on the cell wall, and is secreted. PbMLS was overexpressed in Escherichia coli, and polyclonal antibody against this protein was obtained. By using Confocal Laser Scanning Microscopy and Western blot analysis, PbMLS was detected in the cytoplasm and the cell wall of the yeast phase of P. brasiliensis of mother and bud yeast cells. PbMLSr and the respective polyclonal antibody produced against this protein inhibited the interaction of P. brasiliensis to in vitro cultured epithelial cells A549. These observations indicated that cell wall-associated MLS of P. brasiliensis could be mediating the binding of fungal cells, thus contributing to the adhesion of fungus to host tissues and to the dissemination of infection. / O fungo de patogênico Paracoccidioides brasiliensis agente causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose pulmonar adquirida pela inalação de propágulos aéreos do fungo que pode se disseminar a vários órgãos e tecidos levando a uma forma severa da doença. Dentro do hospedeiro, P. brasiliensis usa o ciclo do glioxalato (CG) para sobrevivência intracelular. Adesão e invasão das células do hospedeiro são passos essenciais envolvidos na internalização e disseminação do patógeno. Aqui, nós evidênciamos que malato sintase de P. brasiliensis (PbMLS) é secretada, e é localizada na parede da célula. PbMLS foi superexpressa em Escherichia coli, e o anticorpo policlonal contra esta proteína foi obtido. Usando Microscopia Laser Confocal (CLSM) e análise de Western blot, PbMLS foi encontrada no citoplasma e na parede da célula na fase leveduriforme de P. brasiliensis nas células mãe e broto. PbMLSr e o respectivo anticorpo policlonal produzido contra esta proteína inibiram a interação de P. brasiliensis com células epiteliais A549 cultivads in vitro. Estas observações indicariam que MLS associada à parede da célula de P. brasiliensis pode estar mediando a ligação do fungo às células, contribuindo assim com a adesão do fungo aos tecidos hospedeiros e para a disseminação da infecção.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Sarah Veloso Nogueira.pdf: 4968384 bytes, checksum: 1a3070a4c2260fba10919cd4f6ccd4f4 (MD5) Previous issue date: 2010-03-11 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a human systemic mycosis, prevalent in Latin America. Extracellular matrix (ECM) is a complex net where collagens, laminin and fibronectin can be found and, when exposed, is the first site for the fungus adhesion. Our aim was to study genes involved in the adhesion process using Representational Difference Analysis (RDA). RDA is a PCR-coupled subtractive method that allows the isolation of genes differentially expressed in two different cDNA populations. Hence, cDNAs were synthesized from RNAs extracted from P. brasiliensis yeast cells adhered to collagen and fibronectin to identify overexpressed genes. Genes involved in a wide range of cellular process were found and PbCtr3 (cooper transporter) and enolase (PbEno) were chosen to further studies. A synthetic peptide (PbCTR3) and the recombinant enolase (rPbEno) were utilized together with the anti-rPbEno polyclonal antibody in functional analysis with ECM components and plasminogen. The studies suggest that P. brasiliensis enolase, in the surface, is able to generate plasmin from plasminogen by plasminogen activator. Therefore, it was also demonstrated that this protein is secreted and able to promote fungus adhesion and invasion to cells. These findings clearly establish the role of enolase in the patogenicity of P. brasiliensis. / Paraccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente na América Latina. A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa formada por colágeno, laminina, fibronectina, entre outros componentes, que, quando exposta, é o local inicial de adesão do fungo. Nosso objetivo foi estudar genes envolvidos nesse processo de adesão utilizando Análise Diferencial Representacional (RDA). RDA é um método de subtração acoplado a PCR que permite o isolamento de genes diferencialmente expressos entre duas populações de cDNAs diferentes. Assim, cDNAs foram sintetizados a partir de RNAs extraídos de células leveduriformes de P. brasiliensis aderidos à colágeno e fibronectina para identificar genes super-expressos nestas condições. Genes envolvidos com vários processos celulares foram observados e PbCtr3 (transportador de cobre) e enolase (PbEno) foram escolhidos para análises adicionais. Um peptídeo sintético (PbCTR3) e a proteína recombinante (rPbEno) foram utilizados, juntamente com o anticorpo policlonal antirPbEno em análises funcionais com componentes da MEC e plasminogênio. Os estudos sugerem que a enolase de P. brasiliensis, localizada na parede celular, é capaz de gerar plasmina a partir do plasminogênio mediada pelo ativador de plasminôgenio. Além disso, foi também demonstrado que esta proteína é secretada sendo capaz de promover a adesão e invasão do fungo a células. Esses estudos claramente estabelecem o papel da enolase na patogenicidade de P. brasiliensis.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia kott.pdf: 7658177 bytes, checksum: ad9ad7831fb8596c7e55d3b1f0eee117 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic human pathogenic fungus that lives at 23”C in the mycelium phase (infecting phase) and at 37”C in the yeast phase (parasite phase). In attempt to survive, the cell wall of fungi can change its composition and/or structure in response to environmental stress by compensatory mechanisms. The molecules involved in these mechanisms are possible target for the development of effective antifungal agents. In P. brasiliensis, the main components of the cell wall are glucans and chitin polymers. These polymers make a primary barrier that is responsible for the structural integrity and form of the cell wall. In this work the behavior of P. brasiliensis was evaluated against stress conditions with the aim of study, for the first time, the mechanisms used by this fungus in the maintenance of the cell wall integrity. Our results shown that P. brasiliensis yeast cells are sensitive to cell wall stressors calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, KCl, NaCl and sorbitol. There was an increase in the PbFKS1 transcripts expression and in the content of cell wall β- 1,3-glicana after treatment with all stressor agents. After treatment with SDS and KCl the PbGFA1 transcripts expression and the cell wall GlcNAc residues also increased. The transcript expression of PbGEL3 was also evaluated being increased after treatment with CFW, NaCl and sorbitol. Thus we showed that these molecules are involved in the maintenance of the cell wall against stress conditions. Apart from these analyses we obtained the active recombinant protein PbFks1pc. Through the anti-PbFks1pc antibody we performed immunocitolocalization assays. These experiments revealed the localization of PbFks1p in regions of apical growth in the mycelium phase and in the cell surface in yeast phase. / Paracoccidioides brasiliensis Š um fungo patog‰nico e termodim‚rfico que se apresenta na forma de micŠlio a 23”C (forma infectante) e na forma de levedura a 37”C (forma parasit€ria). A parede celular de fungos Š capaz de alterar sua composiƒ o e atŠ mesmo sua estrutura em resposta a condiƒ•es ambientais de estresse atravŠs de mecanismos compensat‚rios. As prote…nas envolvidas nestes mecanismos s o poss…veis alvos para o desenvolvimento de agentes antifˆngicos espec…ficos. Em P. brasiliensis, os principais pol…meros que constituem a parede celular s o glicanas e quitina. Estes pol…meros formam uma barreira prim€ria que Š respons€vel pela integridade estrutural e forma da parede celular. Neste trabalho, o comportamento de P. brasiliensis diante de situaƒ•es de estresse foi investigado com o intuito de estudar, pela primeira vez, os mecanismos utilizados por este fungo na manutenƒ o da integridade da parede celular. Nossos resultados mostram que cŠlulas leveduriformes de P. brasiliensis s o sens…veis aos agentes estressores da parede celular calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, NaCl, KCl e sorbitol. Houve um aumento na express o de transcritos de PbFKS1 e no conteˆdo do pol…mero de β-1,3-glicana na parede celular ap‚s tratamento com todos os agentes estressores. Ap‚s tratamento com SDS e KCl a express o de transcritos de PbGFA1 assim como o conteˆdo de res…duos de GlcNAc na parede celular tambŠm aumentaram. A express o dos transcritos de PbGEL3 tambŠm foi avaliada estando aumentada ap‚s tratamento com CFW, NaCl e sorbitol. Desta forma, mostramos que estas molŠculas est o envolvidas na manutenƒ o da parede celular diante de situaƒ•es de estresse. AlŠm destas an€lises, a prote…na recombinante PbFks1pc ativa foi obtida. AtravŠs do anticorpo anti-PbFks1pc realizamos ensaios de imunocitolocalizaƒ o. Estes experimentos revelaram a presenƒa de PbFks1p em regi•es de crescimento apical no micŠlio e na superf…cie celular em cŠlulas leveduriformes.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese sabrina.pdf: 5211450 bytes, checksum: 0bc9c15d9e2f434943a2738627937629 (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / Paracoccidioides brasiliensis causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis presenting clinical manifestations ranging from mild to severe forms. A P. brasiliensis cDNA expression library was produced and screened with pooled sera from PCM patients adsorbed against antigens derived from in vitro-grown P. brasiliensis yeast cells. Sequencing DNA inserts from clones reactive with PCM patients sera indicated 35 open reading frames presenting homology to genes involved in metabolic pathways, transport, among other predicted functions. The complete cDNAs encoding aromatic L-amino acid decarboxylase (Pbddc), lumazine synthase (Pbls) and a homologue of the high affinity copper transporter (Pbctr3) were obtained. Recombinant proteins PbDDC and PbLS were obtained; a peptide was synthesized for PbCTR3. The proteins and the synthetic peptide were recognized by sera of patients with confirmed PCM and not by sera of healthy patients. Using the vivo-induced antigen technology (IVIAT) we identified immunogenic proteins expressed at high levels during infection. Quantitative real - time RT-PCR demonstrated high transcript levels of Pbddc, Pbls and Pbctr3 in yeast cells infecting macrophages. Transcripts in yeast cells derived from spleen and liver of infected mice were also measured by qRT-PCR. Our results suggest a putative role for the immunogenic proteins in the infectious process of P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente nos países da América Latina. Uma biblioteca de cDNA de expressão de Paracoccidioides brasiliensis foi construída e rastreada com soros de pacientes acometidos por paracoccidioidomicose (PCM). Foram identificados 35 clones de cDNAs que codificam proteínas relacionadas com metabolismo celular, transporte, energia, transcrição, endereçamento de proteínas, transdução de sinal e componentes celulares. Os cDNAs codificantes da L- aminoacido aromatico - descarboxilase (Pbddc), da lumazina sintase (Pbls) e do transportador de cobre de alta afinidade foram obtidos. As proteínas recombinantes PbDDC e PbLS e o peptídio sintético PbCTR3 foram reconhecidos por soros de pacientes com PCM e não reagiram com soros controle. A técnica de IVIAT (tecnologia de antígenos induzidos in vivo) propiciou a identificação de proteínas imunogênicas mais expressas durante o processo infecçioso. RT-PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) demostrou altos níveis de transcritos de Pbddc, Pbls e Pbctr3 em células leveduriformes infectando macrófagos. O transcritos de células leveduriformes de P. brasiliensis recuperadas de fígado e baço de camundongos foram medidos por qRT-PCR. Estes resultados sugerem o provável papel das proteínas imunogênicas no processo infeccioso de P. brasiliensis.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Silva do Prado.pdf: 1314483 bytes, checksum: 0832c7a22af0d5f60e10293a7d47b2d0 (MD5) Previous issue date: 2010-11-20 / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomicosys (PCM), the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. The toxicity of drugs and the appearance of resistant strains have imposition the search for new therapeutic approaches. Plants with reputed antimicrobial uses represent a rich source for the screening of potential antifungal compounds. In this work, we investigated the inhibitory action of argentilactone, extracted from the essential oil of Hyptis ovalifolia, and its analogues on P. brasiliensis yeast cells, during the differentiation from mycelium to yeast, on native and recombinant PbICL. Sensitivity tests on plates, which assessed the activity of argentilactone on yeast cells of P. brasiliensis showed both argentilactone as reduced argentilactone interfered in fungus growth, affecting the cells in a dose-dependent way. The experiments evaluating the minimum inhibitory concentration (MIC), which evaluated the influence of the compounds during the transition from mycelium to yeast in P. brasiliensis showed that argentilactone and reduced argentilactone interferes in this process, also in a dose-dependent way. A specific activity of isocitrate lyase of the fungus, both recombinant as native, as measured by tests of enzyme activity was also affected by the compounds. The type of inhibition promoted by argentilactone and reduced argentilactone was defined as inhibition of mixed type through tests of enzyme kinetics. Different carbon sources (acetate and glucose) have directly influence on the processs of inhibition. The analogues epoxy argentilactone and diol argentilactone not inhibit the growth and differentiation of P. brasiliensis. In addition, it not inhibited the enzyme isocitrate lyase native or recombinant. / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose humana sistêmica de maior prevalência na América Latina. Devido à toxicidade dos antifúngicos existentes, e ao aparecimento de isolados resistentes, estudos em busca de novas terapias tem adquirido relevância. Plantas com propriedades terapêuticas representam uma fonte em potencial para descoberta de novos antifúngicos. Neste trabalho, foi investigada a influência de argentilactona, extraída do óleo essencial de Hyptis ovalifolia, e seus análogos obtidos sinteticamente sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, durante o processo de diferenciação de micélio para levedura e sobre a enzima isocitrato liase recombinate (PbICLr) e nativa. Os testes de sensibilidade em placas, que avaliaram a atividade de argentilactona sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, mostraram que tanto argentilactona como argentilactona reduzida interferiram no crescimento do fungo, afetando as células de modo dose-dependente. Os experimentos de avaliação de concentração inibitória mínima (CIM), que avaliaram a influência dos compostos durante a transição de micélio para levedura em P. brasiliensis mostraram que argentilactona e argentilactona reduzida interferem nesse processo, também de modo dose-dependente. A atividade específica da isocitrato liase do fungo, tanto recombinante como nativa, mensurada por testes de atividade enzimática, também foi afetada pelos compostos. O tipo de inibição promovida pela argentilactona e argentilactona reduzida foi definido como inibição do tipo mista, através de testes de cinética enzimática. Diferentes fontes de carbono (acetato e glicose) influenciaram diretamente o processo de inibição. Os análogos epoxi argentilactona e diol argentilactona não inibiram o crescimento de células leveduriformes e o processo de diferenciação de P. brasiliensis. Em adição, também não inibiram a atividade da enzima isocitrato liase recombinante e nativa.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kelly Pacheco de Castro.pdf: 746240 bytes, checksum: b56c21e04b1a4191824bfab81746d0d2 (MD5) Previous issue date: 2008-01-31 / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of the most frequent systemic mycosis in Latin America. In humans, infection starts by inhalation of fungal propagules, which reach the pulmonary epithelium and differentiate into the yeast parasitic phase. Here we describe the characterization of a proline-rich protein (PRA/Ag2) homologue of P. brasiliensis, a predictable cell wall protein, first identified in Coccidioides immitis. The protein, the cDNA and genomic sequences were analyzed. Southern blot analysis suggested that there is one copy of the gene in P. brasiliensis. The cloned cDNA was expressed in Escherichia coli and the purified rPbPRA/Ag2 was used to obtain polyclonal antibody. The purified recombinant protein was recognized by sera of patients with proven paracoccidioidomycosis and not by sera of healthy individuals. Immunoelectron microscopy and biochemical studies demonstrated the presence of PbPRA/Ag2 in the fungal cell wall, linked through a GPIanchor. The expression of the Pbpra/ag2 gene was analyzed by real time PCR and results demonstrated developmental regulation in phases of P. brasiliensis, with a higher expression in the mycelium saprobic phase. The protein expression analyses corroborate the transcript levels. / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Em humanos, a infecção se dá pela inalação de propágulos do fungo, que ao alcançarem o epitélio pulmonar transformam se na fase leveduriforme, parasitária, do fungo P. brasiliensis. Neste trabalho,descrevemos a caracterização de um homólogo de PRA/Ag2 (Antígeno rico em prolina), uma proteína predita de parede celular, primeiramente identificada em Coccidioides immitis. A proteína, o cDNA e a seqüência genômica foram analisados. Análises através de Southern blot sugerem que há somente uma cópia do gene em P.brasiliensis. O cDNA clonado foi expresso em Escherichia coli e a rPbPRA/Ag2 purificada foi utilizada para obtenção do anticorpo policlonal. A proteína recombinante purificada foi reconhecida pelo soro de pacientes com paracoccidioidomicose comprovada e não foi reconhecida pelo soro de pacientes saudáveis. Microscopia eletrônica e estudos bioquímicos demonstraram a presença do PbPRA/Ag2 na parede celular de P. brasiliensis, ligada através de uma âncora de GPI. A expressão do gene que codifica Pbpra/ag2 foi analisada através de PCR em Tempo Real e os resultados demonstraram regulação da expressão nas fases de P. brasiliensis, com maior nível de expressão na fase miceliana. Análises da expressão protéica corroboram os resultados da RT-PCR em Tempo Real.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia de sousa.pdf: 7071029 bytes, checksum: 82c8213b4442879d206467555a97c3c4 (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations. The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially composed of branched glucan (β-1,3 and β-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins. Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3- glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae GAS1Δ. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works as a β-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition, predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P. brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2 (involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle), phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por glicanas ramificadas (ligações β-1,3 e β-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2 (PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido. Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo mutante para GAS1Δ de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da β-1,3- glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B (requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da integridade da parede celular.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Deyze Alencar Soares.pdf: 632456 bytes, checksum: 33012995df8eabb3f4b7509fe372764d (MD5) Previous issue date: 2010-03-26 / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of the most prevalent systemic mycosis in Latin America, paracoccidioidomycosis. The phospholipase B (PLB) enzyme is considered an important virulence factor in this dimorphic fungus, involved in the immune response of the host-pathogen interaction. Our objective was to determine whether a P. brasiliensis (Pb18) PLB is involved in adhesion / internalization of yeast and evasion of host immune responses. The effect of PLB was analysed using specific inhibition of PLB (alexidine dihydrochloride) and pulmonary surfactant in an ex vivo model (Pb18) of alveolar macrophage (MHS cells) infection. PLB enzyme assays and real time RT-PCR (qRTPCR) analysis of genes differentially expressed in the process of evasion: plb1 (phospholipase B1), icl1 (isocitrate lyase) and sod3 (Cu, Zn dismutase) and immune responses: clec2 (C-type lectin domain 2), cd14 (cluster of differentiation 14), tlr2 (toll-like receptor 2), nfkb (nuclear factor kappa B), nkrf (NF-kappaB repressing factor), il1β (inteleukin-1β) and tnfα (tumor necrosis factor alpha) were carried out using selective inhibition of PLB activity and pulmonary surfactant. The levels of cytokines inteleukin 10 (IL-10), IL-12 and TNF-α) were also determined by ELISA. PLB activity under adhesion conditions of P. brasiliensis (Pb18) to alveolar macrophage cells was found at high levels up to 6 hours post-infection. In the conditions of exposure to pulmonary surfactant and alexidine dihydrochloride, PLB activity and the level of transcripts of genes related to phagocytosis and inflammatory response were measured. We found that PLB activity had an influence on the phagocytic activity of alveolar macrophages. Alexidine dihydrochloride (0,25 μM) selectively inhibited PLB activity by 66% and decreased significantly the adhesion and internalization of yeast on MHS cells. Genes involved in phagocytosis (trl2 and cd14) and inflammatory response (nrkf, tnfα and il1β) were down-regulated in the presence of the PLB inhibitor. In contrast, the PLB activity and internalization of fungal yeast cells increased significantly in the presence of pulmonary surfactant (100 μg/mL) and genes such as clec2, important for effective phagocytosis by MHS cells, and the pro-inflammatory inhibitor (nkrf) were up-regulated. Also, the pulmonary surfactant did not alter cytokine production, while alexidine dihydrochloride decreased the levels of IL-10 and increased the levels of IL-12 and TNF-α. In addition, through simultaneous analyses of gene expression for the pathogen, P. brasiliensis, we found upregulation of the genes sod3, icl1 and plb1, required for the evasion of alveolar macrophages. P. brasiliensis PLB is important for the binding and internalization of yeast at macrophage surfaces. The specific effect of inhibiting PLB enzyme activity indicates that adhesion may be facilitated indirectly via fatty acid release from phospholipids of the membrane of host cells. This is the first study to show that PLB activity may modulate immune responses to P. brasiliensis infection. / Paracoccidioides brasiliensis, fungo dimórfico, é o agente etiológico principal micose sistêmica da América Latina, paracoccidioidomicose. A enzima fosfolipase B (PLB) é considerada um importante fator de virulência nesse fungo dimórfico e está envolvida na resposta imune da interação patógeno-hospedeiro. Nosso objetivo foi determinar se a PLB de P. brasiliensis (Pb18) está envolvida na adesão e internalização de leveduras e na evasão da resposta imune hospedeira. O efeito da PLB foi analisado usando o inibidor seletivo de PLB (alexidine dihydrochloride) e o surfactante pulmonar (Survanta) em um modelo ex vivo de infecção de macrófagos alveolares (MHS) com Pb18. Ensaio enzimático de PLB e análise de genes diferencialmente expressos por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) no processo de evasão: plb1 (fosfolipase B1), icl1 (isocitrato liase) e sod3 (Cu, Zn dismutase); e na resposta imune: clec2 (lecitina tipo-C 2), cd14 (cluster de diferenciação 14), tlr2 (receptor toll-like 2), nfkb (fator nuclear kappaB), nkrf (repressor fator nuclear kappaB), il1β (interleucina- 1 beta) e tnfα (fator de necrose tumoral alfa) foram realizados usando o inibidor seletivo da atividade de PLB e surfactante pulmonar. Os níveis de citocinas interleucina 10 (IL-10), IL-12 e TNF- α) foram determinados por ELISA. A atividade de PLB usadas em baixas condições para a adesão de P. brasiliensis (Pb18) obteve altos níveis em 6 horas pós-infecção. Na presença do surfactante pulmonar e alexidine dihydrochloride, a atividade da PLB e os níveis de transcritos dos genes relacionados à fagocitose e à resposta inflamatória foram quantificados. A PLB teve influência na atividade fagocítica dos macrófagos. Alexidine dihydrochloride (0,25 μM) inibiu seletivamente a atividade PLB em 66% e diminuiu significativamente a adesão e internalização de leveduras por macrófagos alveolares (MHS). Genes envolvidos na fagocitose (trl2 e cd14) e resposta inflamatória (nrkf, tnfα e il1β) foram reprimidos na presença do inibidor de PLB. Em contraste, a atividade PLB e internalização de leveduras aumentou significativamente na presença do surfactante pulmonar (100 μg/mL) e genes assim como clec2, importante para uma fagocitose efetiva pelos macrófagos alveolares (MHS), e o inibidor pró-inflamatório (nkrf) foram induzidos. Entretanto, o surfactante pulmonar não alterou a produção de citocinas, enquanto que alexidine dihydrochloride diminuiu os níveis de IL-10 e aumentou os níveis de IL-12 e TNF-α. Em adição, nas análises simultâneas de expressão de genes, P. brasiliensis, houve indução dos genes sod3, icl1 e plb1, requeridos para a evasão dos macrófagos alveolares. A PLB de P. brasiliensis é importante na adesão e internalização de leveduras pelos macrófagos alveolares. O efeito específico da inibição da atividade da PLB indica que a adesão pode ser facilitada indiretamente via liberação de ácidos graxos dos fosfolipídeos de membrana das células hospedeiras. Esse é o primeiro estudo mostrando que a atividade da PLB pode modular a resposta imune à infecção pelo P. brasiliensis.