Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O gênero Klebsiella faz parte da família Enterobacteriaceae e pode ser encontrado no meio ambiente e nas mucosas de seres humanos e animais. Atualmente, o gênero é composto de cinco espécies, das quais a K. pneumoniae, e mais raramente, a K. oxytoca, são causadoras de infecções. As infecções por K. pneumoniae acometem primordialmente indivíduos hospitalizados, geralmente fragilizados por outras condições, que acabam, na maioria das vezes, desenvolvendo infecções do trato urinário, lesões supurativas, bacteremias e septicemia. Além disso, a K. pneumoniae encontra-se entre as espécies mais comumente implicadas em infecções por microorganismos resistentes a antibióticos, sendo, depois de Escherichia coli, a causa mais comum de septicemia por Gramnegativos. O primeiro estágio da infecção hospitalar por K. pneumoniae consiste na colonização do trato gastrointestinal. A translocação bacteriana (TB), definida como a passagem de bactérias viáveis através da mucosa intestinal, é um processo endógeno que se coloca como hipótese para a ocorrência dessas infecções. A colonização intestinal demanda que as bactérias estejam firmemente estabelecidas na superfície da mucosa para resistir aos movimentos peristálticos do intestino. A proteína CF29K, descrita em uma amostra clínica de K. pneumoniae, é uma adesina não fimbrial que demonstrou mediar uma adesão do tipo difuso em células cultivadas de origem intestinal. Praticamente, não há relatos sobre o papel desta adesina no potencial patogênico de K. pneumoniae. Tampouco há demonstração da capacidade de K. pneumoniae translocar por via intestinal em modelo animal imunologicamente competente e que não apresente lesão da barreira mucosa. O objetivo geral deste trabalho foi estudar o envolvimento da adesina afimbrial CF29K no processo de translocação de K. pneumoniae por via intestinal. O ensaio de TB realizado em modelo in vivo, mostrou que a K. pneumoniae CF504, protótipo de CF29K, é capaz de translocar para linfonodos do mesentério, fígado e baço. Este achado reveste-se de grande consistência na medida em que o modelo de TB empregado não expõe o animal a fatores que levam ao dano da barreira intestinal. A supressão da expressão da adesina CF29K, obtida por mutagênese específica do gene cf29A, da amostra K. pneumoniae CF504, não interferiu na sua capacidade de aderir a células Caco-2, sugerindo que outra(s) adesina(s) também deva desempenhar este papel na amostra selvagem. Da mesma forma, a ausência de CF29K não resultou em menor eficiência de translocação por via intestinal. Além disso, o estudo de 27 amostras clínicas de K. pneumoniae não detectou o gene cf29A em nenhum dos isolados. No entanto, o teste de TB realizado com 15 dessas amostras resultou positivo. Concluise, portanto, que a translocação bacteriana por via intestinal é um processo que independe da adesina CF29K e que deve refletir um possível mecanismo de patogenicidade de K. pneumoniae envolvido, seja na instalação da infecção per se, seja no agravamento de quadros infecciosos sistêmicos já instalados. / Klebsiella is a member of the family Enterobacteriaceae and can be isolated from the environment and from the mucosal surfaces of human beings and animals. There are five known species of Klebsiella, being K. pneumoniae and K. oxytoca the most associated with infections. Mainly hospitalized patients are infected and can present urinary tract infections, supurative lesions, bacteremia, and septicemia. K. pneumoniae strains presenting high resistance to antibiotics are the most common Gram negatives causing septicemia after Escherichia coli. Colonization of the intestinal tract is the first stage in the nosocomial infections by K. pneumoniae. Being so, bacterial translocation (BT), defined as the passage of viable bacteria through the intestinal barrier, is an endogenous process that applies as a hypotheses for the occurrence of those infections. Intestinal colonization demands a firm interaction between the bacteria and the mucosal surface so they can resist to the intestinal peristalses. The CF29K protein discovered in a clinical isolate of K. pneumoniae, is an afimbrial adhesin responsible for diffuse adhesion to intestinal cells in vitro. There is no acknowledge on the role of this adhesin to the pathogenesis of K. pneumoniae, neither on the ability of these bacteria to translocate through the intact intestinal barrier of immunological competent animal models. The aim of this study was to evaluate the involvement of the adhesin CF29K in the BT process. It was shown that CF504, the prototype K. pneumoniae strain for CF29K, is able to translocate trough the intestinal barrier of rats, being recovered from mesenteric lymph nodes, liver, and spleen, after two hours of inoculation. This fact gains importance since the BT assay used causes no physical damage to the intestinal mucosa. The suppression of the CF29K protein expression obtained by site-direct mutagenesis of the cf29A gene of the prototype strain did not change its ability to adherer to Caco-2 cells, suggesting that there might be other (s) adhesin(s) also involved in this interaction. Nevertheless, the absence of CF29K did not abolish the BT capacity of the strain. Besides, the study of 27 clinical isolates of K. pneumoniae did not detect the presence of cf29A gene in any strain. Even so, the BT test carried out with 15 of those isolates resulted positive. We conclude that BT across the intestinal mucosa is a process not related to the adhesin CF29K. We propose that BT may reflect a possible mechanism of pathogenicity of K. pneumoniae involved either in the installation of the infection, or in the worsening of already installed systemic infection. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:14:39Z : No. of bitstreams: 1 donofrio_fc_me_arafcf.pdf: 611507 bytes, checksum: 2ca5a08dde5671c30f12d9904897bfcb (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A capacidade de Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), de causar doença com manifestações clínicas variadas, depende de seus fatores de virulência, em particular daqueles envolvidos na interação celular. Neste estudo pretendeu-se isolar e caracterizar adesina(s) de P. brasiliensis ligante(s) de fibronectina relacionadas à interação do fungo com células epiteliais de origem pulmonar, comparando amostras de P. brasiliensis, antes (18a) e depois (18b) da passagem em animal, posteriormente cultivadas em meio de Fava Netto e em meio sólido (ágar base) e líquido (BHI) contendo 5% de sangue de carneiro. Os extratos 18a e 18b obtidos dos diferentes meios apresentaram proteínas variando de 106 a 12 kDa. Os extratos da amostra 18a e 18b cultivados em meios sólido e líquido acrescidos de sangue demonstraram maior expressão de algumas proteínas, quando comparado às amostras 18a e 18b cultivadas apenas em meio de Fava Netto. Aparentemente, o uso de meios de cultura acrescidos de sangue é semelhante ao verificado após a passagem em animal. As proteínas com massas moleculares de 54 kDa e pI de 5,6; 58 kDa e pI de 5,9 e 60 kDa com pI de 6,3 foram caracterizadas como adesinas ligantes de fibronectina. Uma delas, a proteína de 54 kDa foi purificada por cromatografia de afinidade e eluída por eletroeluição. O sobrenadante contendo a proteína purificada foi avaliado por eletroforese bidimensional, confirmando a presença da proteína de 54 kDa e pI de 5,6 e seu papel como adesina. Os extratos cell-free dos isolados 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 de P. brasiliensis... / The capacity of Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), to provoke illnesses with great variety of clinical manifestations depends on its virulence factors, particularly on those involved in the cellular interaction. The present study was designed to isolate and characterize the adhesin fibronectin-binding related to the capacity of this fungus to adhere to the host by comparing P. brasiliensis samples, taken before (18a) and after (18b) animal inoculation and cultured on Fava Netto s medium and on blood base agar solid medium and liquid (BHI) medium with 5% sheep blood. The 18a and 18b extracts, independent of the medium, presented proteins with the molecular weights of 106 and 12 kDa. Extracts from Pb18a and 18b cultured in blood agar solid and liquid (BHI) medium showed higher levels of protein expression than that from samples cultured on Fava Netto. Apparently, the use of the sheep blood in the medium is similar to the animal passage. Ligand affinity binding assays showed that proteins of 54 kDa, pI 5.6; 58 kDa and pI of 5.9 and 60 kDa and pI de 6.3 were evident in all P. brasiliensis cell-free extracts, and all had properties of adhesin fibronectin-binding. A fibronectin-binding protein of 54 kDa was purified by affinity chromatography and by electro elution. The protein purified was evaluated by isoelectric focusing, confirming the presence of protein of 54 kDa and pI of 5.6 and its role as an adhesin. The cell-free extracts from 113, 339, 2663-R3, 2681, PB01, 1934 P. brasiliensis isolates, also showed the expression of 54 kDa protein, and it was more evident in 113 and 339 isolates. Our experiments... (Complete abstract click electronic access below)

A leptospirose é uma zoonose mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais domésticos e silvestres e são liberadas ao ambiente externo pela urina. Neste estudo avaliou-se a interação de seis prováveis lipoproteínas de membrana externa de leptospira com as proteínas do hospedeiro: colágeno I, colágeno IV, elastina, fibrinogênio, fibronectina celular e plasmática, laminina e plasminogênio. Os experimentos de adesão demonstraram que as proteínas recombinantes Lp21, Lp22 e Lsa30 apresentaram interação com os componentes do hospedeiro de maneira dose-dependente. Estas aderiram à fibronectina plasmática e laminina, além destes, a Lp21 e a Lp22 interagiram com plasminogênio, a Lp22 e a Lsa30 interagiram com colágeno IV. A Lp22 aderiu à elastina e ao fibrinogênio. No estudo de conservação gênica, os genes que codificam estas proteínas foram observados somente nas Leptospiras patogênicas. Portanto estas proteínas devem contribuir na adesão aos tecidos do hospedeiro na patogênese da Leptospira. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that colonize the renal tubules of wild and domestic animals and are excreted in the environment by their urine. The aim of this work was to study the interaction of six leptospiral probable outer-membrane lipoproteins with host proteins: collagen I, collagen IV, elastin, fibrinogen, cellular fibronectin, plasma fibronectin, laminin, and plasminogen. The binding experiments demonstrated that the recombinant proteins showed interaction with host components in a dose-dependent manner were Lp21, Lsa30 and Lp22. These proteins adhered to plasma fibronectin and laminin, in addition to these components, Lp21 and Lp22 interacted with plasminogen, Lp22 and Lsa30 interacted with collagen IV. The Lp22 adhered to elastin and fibrinogen. The genes encoding the probable lipoproteins were found only in pathogenic Leptospira. These results demonstrated that these proteins may contribute in the adhesion to host tissues, in the pathogenesis of Leptospira.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O sorogrupo O26 de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) atípica é um dos sorogrupos mais frequentes implicados na diarréia infantil, sendo um sorogrupo muito comum também em amostras de E. coli enterohemorrágica (EHEC). O sorotipo mais frequente dentro do sorogrupo O26 tanto em amostras de EPEC quanto em amostras de EHEC é a O26:H11. Num recente estudo, amostras de EPEC atípica O26:H11 isoladas de crianças com diarréia apresentaram um padrão de adesão localizado (AL), porém eram desprovidas da fímbria BFP responsável pelo fenótipo AL das EPEC típicas. Uma dessas amostras, E. coli 22, foi escolhida para caracterização de seus determinantes genéticos. Foi construída uma biblioteca genômica da amostra 22 na E. coli DH5α e identificado um clone cosmídeo denominado pV-B-6, aderente a células HeLa. O clone pV-B-6 exibiu um padrão de adesão difusa (AD) sobre as células epiteliais, diferente da formação de microcolônias presentes na adesão AL apresentada pela amostra 22. O cosmídio pV-B-6 foi submetido a mutagênese utilizando o transposon mini-Tn10::kan e identificado um mutante não aderente (pV-B-6-Tn). Um fragmento de 2,3 kb EcoRI-HindIII contendo 1 kb do mini-Tn10 foi clonado, sendo identificado um gene, ldaH, que possuía 73% de identidade com a subunidade fimbrial faeH da de fímbria K88 ETEC. Essa região foi denominada de “locus for diffuse adherence” (lda). O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a adesina codificada pelo locus lda, a qual é responsável por conferir o padrão AD a células HEp-2 na amostra pV-B-6. A análise em SDS-PAGE de extratos parcialmente purificados das amostras 22 e pV-B-6 mostrou uma banda protéica de aproximadamente 25 kDa, que estava ausente nos extratos do mutante pV-B-6-Tn. A proteína de 25 kDa foi cortada do gel, sendo determinado o sequenciamento da região amino-terminal. A sequência de aminoácidos correspondeu ‡ forma madura de LdaG, a principal subunidade estrutural da adesina. A expressão de Lda foi induzida em meio ágar MacConkey a 37o C. Para demonstrar que a adesina LDA era a responsável pelo padrão AD a células HEp-2, foi produzido um anti-soro LdaG em coelho. A especificidade do soro anti-LdaG foi determinada pela reação de “Imuno blot”. Apenas a proteína de 25 kDa foi reconhecida pelo soro imune, apresentando uma reação fortemente positiva com a amostra selvagem E. coli 22 e com o clone pV-B-6. Nenhuma reação do soro anti-LdaG foi observada no mutante, demonstrando, assim, a especificidade desse soro. Ensaios de inibição de adesão revelaram que o anti-soro LdaG reconheceu os epítopos da adesina responsáveis pela fenótipo AD, visto que foi capaz de inibir totalmente a adesão do clone pV-B-6. A imunomarcação com o anti-soro LdaG identificou na amostra 22 uma matriz de superfície amorfa sem nenhuma aparência de estrutura fimbrial. Quando observado em aumento maior, verificou-se a presença de estruturas fibrilares muito finas formando estruturas semelhantes a uma malha. Em contrapartida, nenhuma marcação foi observada no mutante LDA1. Foi determinada a incidência do gene ldaH em 65 amostras de EPEC atípica, isoladas em diferentes cidades brasileiras de crianças com diarreia aguda e de controles e pertencentes a 34 diferentes sorogrupos. Nenhuma dessas 65 amostras produtoras do padrão ALL em ensaios de 6 horas apresentou a sequência ldaH. Também foram estudadas 13 amostras de EPEC atípica que pertenciam aos sorogrupos O26, O55 e O111. O gene ldaH foi encontrado em quatro amostras, todas do sorogrupo O26 e que apresentavam o padrão AL em ensaios de três horas. No entanto, tanto os experimentos de PCR para amplificação do gene estrutural ldaG, como os experimentos de “Imuno blot” utilizando o anti-soro LdaG não revelaram a proteína de 25 KDa. Ensaios de inibição de adesão e imunofluorescência com soro antiK88 foram realizados com o intuito de investigar a relação antigênica entre as adesinas LDA e K88. Os resultados mostraram que ambas as adesinas são antigenicamente distintas, uma vez, que o soro anti-K88 não inibiu a AD e nem reconheceu qualquer estrutura presente na superfície da amostra pV-B-6. Neste estudo foi avaliado o papel da adesina LDA na virulência bacteriana, utilizando o modelo do camundongo tratado com estreptomicina e comparando a amostra selvagem 22 com a isogênica apresentando deleção do gene ldaG. Os resultados obtidos mostraram que aparentemente, a adesina LDA est· envolvida no processo de colonização, uma vez que a amostra selvagem 22 aderiu e colonizou mais eficientemente o ceco de camundongos C57BL/6J do que a amostra 22 ∆ldaG Concluindo, nossos resultados levaram a identificação e caracterização da adesina LDA responsável pela aderência difusa a células HEp-2. LDA È uma adesina afimbrial que contém uma subunidade principal, LdaG, cuja expressão é induzida em ágar MacConkey a 37o C. Estudos futuros são necessários para caracterizar melhor o papel da adesina LDA na virulência bacteriana. / The O26 serogroup of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one of the most frequently implicated in infant diarrhea and is also common among enterohemorrhagic E. coli (EHEC) strains. The most common O26 strains belong to EPEC/EHEC serotype O26:H11. In a previous report, atypical EPEC strains O26:H11 isolated from children with diarrhea exhibited a localized adherence (LA) pattern within 3 hours, but do not harbor the BFP fimbriae correlated with the LA phenotype of typical EPEC. One isolate, E. coli 22 was used to characterize its genetic determinants. A genomic cosmid library of E. coli 22 was generated in E. coli K12 and the resulting clones were screened for LA adherence to HEp-2 cells. One cosmid clone, pV-B-6, exhibited adherence in a diffuse pattern over the entire epithelial cell rather than the LA microcolony formation seen with E. coli 22. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pV-B-6 responsible for the adhesive phenotype. One isolate tested negative for adherence (pV-B-6-Tn) was chosen for further analysis. DNA sequencing of a subclone of pV-B-6 revealed an open reading frame, ldaH, whose predicted protein product shares 73% amino acid identity with that of the E. coli K88 fimbrial gene faeH. This region was named the locus for diffuse adherence (lda). The aim of this study was to characterize the adhesin encoded by the lda locus that is responsible for mediating diffuse adherence to HEp-2 cells. SDS-PAGE of whole-cell cell lysates from E. coli 22 and pV-B-6 showed a broad band with an apparent molecular mass of 25 kDa, which was absent in the pV-B-6-Tn extracts. The 25-KDa band was excised from the gel, and its N-terminal amino acid sequence determined. The sequence corresponds to the mature form of LdaG, the major structural subunit. The expression of LdaG is induced on MacConkey agar at 37o C. To provide further evidence that the LDA adhesin was responsible for the diffuse adherence seen on HEp-2 cells, we raised polyclonal rabbit antiserum against the major structural subunit LdaG. Imuno blot analysis 17 showed that the antiserum recognized the 25-kDa band present in wildtype E. coli 22 and pV-B-6, but not the pV-B-6-Tn mutant. Treatment of pV-B- 6 with the antiserum completed inhibited diffuse adherence of pV-B-6 to the HEp-2 cells. Immunogold labeling with LdaG antiserum identified an amorphous surface matrix with no obvious fimbrial structure. At higher magnification, very fine wiry fibrils forming mesh-like structures could be visualized. To determine whether the lda locus was specific to our O26:H11 strain or if it is present in other E. coli strains, we performed colony blots and HEp-2 adherence on a collection of 65 atypical EPEC strains representing 34 O serogroups. Most (61.5%) of strains were positive for HEp-2 localized-like adherence assay and all strains were ldaH probe negative. We also tested 13 atypical EPEC strains, which belonged to Dr. Luiz R. Trabulsi and ldaH was found in four O26 LA positive strains. These strains were tested with an ldaG gene probe, but were negative. By using a K88 antiserum, it was possible to demonstrate different antigenic determinants, between LDA and K88 adhesins. A streptomycin-treated mouse model was used to compare the intestinal colonization capacity of E. coli 22 strain with that of its ∆ldaG derivative (LDA1). The results showed that E. coli 22 adheres and colonizes the cecum of C57BL/6J mice more efficiently than the LDA1. In conclusion, we were able to characterize the LDA adhesin responsible for diffuse adherence to HEp-2 cells. LDA is an afimbrial adhesin that contains a major subunit, LdaG, whose expression is induced on MacConkey agar at 37o C. Additional work is needed to characterize the role in virulence of the LDA adhesin. / FAPESP: 01/03525-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A leptospirose é uma zoonose mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais domésticos e silvestres e são liberadas ao ambiente externo pela urina. Neste estudo avaliou-se a interação de seis prováveis lipoproteínas de membrana externa de leptospira com as proteínas do hospedeiro: colágeno I, colágeno IV, elastina, fibrinogênio, fibronectina celular e plasmática, laminina e plasminogênio. Os experimentos de adesão demonstraram que as proteínas recombinantes Lp21, Lp22 e Lsa30 apresentaram interação com os componentes do hospedeiro de maneira dose-dependente. Estas aderiram à fibronectina plasmática e laminina, além destes, a Lp21 e a Lp22 interagiram com plasminogênio, a Lp22 e a Lsa30 interagiram com colágeno IV. A Lp22 aderiu à elastina e ao fibrinogênio. No estudo de conservação gênica, os genes que codificam estas proteínas foram observados somente nas Leptospiras patogênicas. Portanto estas proteínas devem contribuir na adesão aos tecidos do hospedeiro na patogênese da Leptospira. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that colonize the renal tubules of wild and domestic animals and are excreted in the environment by their urine. The aim of this work was to study the interaction of six leptospiral probable outer-membrane lipoproteins with host proteins: collagen I, collagen IV, elastin, fibrinogen, cellular fibronectin, plasma fibronectin, laminin, and plasminogen. The binding experiments demonstrated that the recombinant proteins showed interaction with host components in a dose-dependent manner were Lp21, Lsa30 and Lp22. These proteins adhered to plasma fibronectin and laminin, in addition to these components, Lp21 and Lp22 interacted with plasminogen, Lp22 and Lsa30 interacted with collagen IV. The Lp22 adhered to elastin and fibrinogen. The genes encoding the probable lipoproteins were found only in pathogenic Leptospira. These results demonstrated that these proteins may contribute in the adhesion to host tissues, in the pathogenesis of Leptospira.

Os Staphylococcus spp., são bactérias Gram positivas com importância clinica, as quais são capazes de causar uma ampla variedade de doenças em seres humanos e animais. O uso excessivo de antimicrobianos pode selecionar bactérias resistentes aos antimicrobianos de uso comum em Veterinária, o que representa uma grande ameaça para a saúde animal, e a saúde publica no mundo inteiro. Apesar de sua importância clinica, existe um conhecimento limitado sobre a patogênese das infecções estafilococicas em animais de estimação, e os fatores de virulência bacterianos específicos envolvidos em estas doenças. A Infecção estafilocócica iniciasse a partir da adesão do micro-organismo ao tecido do hospedeiro. A adesão é favorecida pela presença de fatores de virulência conhecidos como adesinas, que estão agrupadas em uma família conhecidas como as microbial surface components recognising adhesive matrix molecules (MSCRAMM). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, 118 estirpes de Staphylococcus spp., foram identificadas, 111 (94.07%), estirpes em cães, e 7 (5.93%) em gatos. Entre os Staphylococcus, sete espécies diferentes foram isoladas: 82 (69.49%) Staphylococcus pseudointermedius, 19 (16.10%) Staphylococcus epidermidis, 7 (5.93%) Staphylococcus xylosus, 4 (3.39%) Staphylococcus chromogenes, 3 (2.54%) Staphylococcus spp., 2 (1.69%) Staphylococcus aureus, 1 (0.85%) Staphylococcus schleiferi. A susceptibilidade a 26 agentes antimicrobianos foi determinada em todos os isolados. A pesquisa pelas MSCRAMM e o gene formador de biofilme nas estirpes de Staphylococcus spp., foi realizada usando a reação em cadeia da polimerasa (PCR), foram usados diferentes pares de primers para detectar os genes que codificam para a proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebpS), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (FnbA), proteína B ligadora de fibronectina (FnbB), e proteína associada a formação de biofilme (Bap). A resistência apresentada pelas estirpes isoladas aos diversos antimicrobianos foi observada com frequência, a percentagem de resistência geral das cepas de Staphylococcus spp isoladas foi: 54,32% para eritromicina, 40,79% para clindamicina, e 29,91% para norfloxacina. A susceptibilidade a oxacilina tambem foi testada, o 85,96% das estirpes isoladas foram susceptíveis. Todos os genes foram identificados com exceção do Bap e EbpS, o gene mais frequentemente isolado foi o Eno (89,9%), a associação entre os genes Eno/Fib/FnbA e Eno/FnbB foram também detectadas. Nossos resultados evidenciaram que os membros do gênero Staphylococcus apresentam frequentemente resistência in vitro aos antimicrobianos usados comumente. É necessário fazer um uso criterioso de antibióticos em animais de estimação em Medicina Veterinária. A informação sobre o assunto pode permitir o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para o tratamento e controle das infeções causadas por Staphylococcus spp., em pequenos animais / Staphylococcus spp., are clinically important Gram-positive bacteria that are capable of causing a wide variety of diseases in humans and animals. The overuse of antimicrobials can select resistant bacteria strains, that represents a major threat to animal and public health worldwide. Despite its clinical importance, there is only very limited knowledge about the pathogenesis of staphylococcal infections in small animals, and the specific bacterial virulence factors involved in causing these diseases. Staphylococcal infection initiates from the adhesion of the microorganism to the tissue of the host. Adhesion is favoured by the presence of virulence factors known as adhesins, which are grouped in a family known as the microbial surface components recognising adhesive matrix molecules (MSCRAMM). After isolation and identification of microorganisms, 118 Staphylococcus strains were identified, 111 (94.07%) strains from canine and 7 (5.93%) from feline origin. Among Staphylococcus, seven different species were isolated: 82 (69.49%) Staphylococcus pseudointermedius, 19 (16.10%) Staphylococcus epidermidis, 7 (5.93%) Staphylococcus xylosus, 4 (3.39%) Staphylococcus chromogenes, 3 (2.54%) Staphylococcus spp., 2 (1.69%) Staphylococcus aureus, 1 (0.85%) Staphylococcus schleiferi. The susceptibility to 26 antimicrobials was determined in all the isolates. The search for MSCRAMM and biofilm-encoding genes in the strains of Staphylococcus spp. was performed using a polymerase chain reaction (PCR). Primers were used to detect the genes encoding for collagen-binding protein (cna), laminin-binding protein (eno), elastin-binding protein (ebpS), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA) and fibronectin-binding protein B (fnbB) and biofilm formation-encoding genes (bap). Resistance of isolates to antibiotics was frequently observed, the percentage of resistance in the general Staphylococcus strains was: 54,32% to erythromycin, 40,79% to clindamycin, and 29,91% to norfloxacin. Susceptibility to oxacilin was also tested, 85,96%) % of the isolates were susceptible. All genes were detected except for ebpS and bap. The most frequently detected gene in both species was eno (89, 9%). Association of genes Eno/Fib/FnbA and Eno/FnbB were also detected. Our results highligthed that members of the Staphylococcus genus often exhibit in vitro resistance to commonly used antimicrobials. Its necessary a judicious use of antibiotics in small animals Veterinary Medicine. Such information on the subject allows the development of more efficient strategies for treatment and control of Staphylococcus infection in small animals

A mastite representa um grande desafio na pecuária leiteira, visto que é uma das afecções que mais acometem o rebanho bovino ocasionando grande impacto econômico. As bactérias são importantes agentes associados à enfermidade, sendo que as mais comumente encontradas são as do gênero Staphylococcus, associadas tanto às manifestações clínicas quanto subclínicas. A terapia antimicrobiana é usualmente requerida como tratamento, auxiliando as defesas do animal para a eliminação do agente invasor, sendo assim, de suma importância monitorar a sensibilidade dos patógenos aos antimicrobianos. Visto que a resistência aos medicamentos utilizados tem se tornado frequente, há a necessidade de estudos mais abrangentes sobre o assunto. Desta forma, o presente estudo avaliou 300 isolados de Staphylococcus provenientes de amostras de leite de bovinos com mastite clínica e/ou subclínica de propriedades de exploração leiteira. A espécie mais detectada nas análises foi S. aureus, e dentre os genes que codificam para adesinas e biofilmes os mais frequentes foram (eno, fib e fnbA) e (bap, icaA, icaD). A combinação mais frequente no tocante às adesinas foi eno-fib-fnbA, e para os biofilmes foram bap e bap-icaD. Os maiores índices de resistência foram verificados para os antimicrobianos betalactâmicos (amoxicilina, ampicilina e penicilina). Identificou-se as maiores frequências de sensibilidade para cefalotina, seguida pela oxacilina e gentamicina, e não foi detectada relação de concordância da oxacilina com os betalactâmicos. Avaliou-se a concentração mínima inibitória (MIC) para ampicilina, gentamicina, oxacilina e penicilina, para todas as cepas resistentes no antibiograma. Posteriormente, investigou-se os genes responsáveis pela codificação de resistência antimicrobiana, com os genes femA e femB sendo os mais comuns, porém o gene femA não foi detectado em todas as cepas de S. aureus. Os genes mecA e bla<//i>Z foram identificados, porém em baixa frequência, e o homólogo de mecA, o mecALGA251, somente em duas cepas. As informações obtidas podem ajudar em diferentes aspectos acerca dos perfis dos microrganismos no tocante aos fatores de virulência dos mesmos, permitindo novas abordagens relativas a terapias e medidas de prevenção à mastite. / Mastitis represents a major challenge in dairy farming, since it is one of the affections that most impact the cattle herd, causing great economic distress. Bacteria are important agents associated with the disease, and the most commonly found are those of the genus Staphylococcus, associated with both clinical and subclinical manifestations. Antimicrobial therapy is usually required as a treatment, assisting the animal\'s defenses to eliminate the invading agent, and it is therefore of paramount importance to monitor the susceptibility of pathogens to antimicrobials. Since resistance to drugs commonly used has become frequent, there is a need for more comprehensive studies on the subject. Thus, the present study evaluated 300 isolates of Staphylococcus from samples of dairy cattle from dairy farms. The most prevalent species in the analyses were S. aureus, and among the genes coding for adhesins and biofilms the most frequent combinations were (eno, fib and fnbA) and (bap, icaA, icaD). The most frequent combination for adhesins was eno-fib-fnbA, and for biofilms they were bap and bap-icaD. The highest resistance indices were verified for betalactam antibiotics (amoxicillin, ampicillin and penicillin). The highest frequencies of sensitivity were identified for cephalothin, followed by oxacillin and gentamicin, and no concordance relationship was found between oxacillin and betalactam. Minimum inhibitory concentration (MIC) for ampicillin, gentamicin, oxacillin and penicillin were performed for all strains resistant to the antibiogram. Subsequently, the genes responsible for the encoding of antimicrobial resistance were investigated, with the femA and femB genes being the most common, but the femA gene was not detected in all strains of S. aureus. The mecA and blaZ genes were identified, but at low frequency, and the mecA homolog, mecALGA251, was only found in two strains. The information obtained can help in different aspects about the microorganisms\' profiles regarding their virulence factors, allowing new approaches to therapies and mastitis prevention measures.

Leptospirose é uma doença infecciosa emergente cujos agentes etiológicos são espécies patogênicas do gênero Leptospira. Leptospiras patogênicas possuem inúmeros genes específicos codificando proteínas com funções desconhecidas, sugerindo que as leptospiras apresentam fatores de virulência únicos. Adesinas bacterianas são importantes fatores de virulência e, assim, a identificação de adesinas conservadas em espécies patogênicas de Leptospira pela construção de bibliotecas genômicas expostas na superfície de bacteriófagos (shotgun phage display), seguida por seleção em células e/ou componentes da matriz extracelular (biopanning), pode revelar novos antígenos e alvos para o tratamento e prevenção da leptospirose. Bibliotecas foram construídas com o DNA genômico de L. interrogans fragmentado e o fagomídeo pG8SAET, sendo testadas algumas abordagens para clonagem como a ligação entre extremidades cegas (blunt-end) e técnicas baseadas em ligação entre extremidades coesivas, incluindo a obtenção de ORESTES e a utilização de adaptadores em grampo. Apesar de serem encontradas algumas limitações, a clonagem por ligação blunt-end se mostrou a mais eficiente para a construção de bibliotecas, sendo adotada para a construção de três bibliotecas em maior escala. A seleção de novas possíveis adesinas a partir das bibliotecas construídas foi realizada em células eucarióticas através da metodologia BRASIL. A primeira biblioteca (BBT1) exibiu 106 clones totais, a partir da qual foram selecionados quatro proteínas em fase apenas com a proteína VIII do fago (pVIII). No entanto, nenhuma delas seria exposta por programas de predição na bactéria. Outras duas bibliotecas foram construídas (BBT2 e BBT3), as quais obtiveram um número ideal de clones para uma ampla cobertura do genoma (>2x107 clones). Por apresentar maior proporção de clones válidos, a BBT2 foi utilizada para a seleção de adesinas, resultando em onze clones em fase com pVIII e/ou sequência sinal do fago. Análises por programas de predição revelaram três proteínas hipotéticas, denominadas LepA962, LepA069 e LepA388, as quais poderiam estar expostas ou ser secretadas pela bactéria, sugerindo uma possível função de adesina. O estudo da proteína LepA388 levou ao reconhecimento de outras doze proteínas semelhantes e pertencentes a uma família paráloga contendo um domínio denominado DUF_61, motivo de função desconhecida presente em proteínas compartilhadas somente entre as espécies patogênicas mais virulentas de Leptospira. Por esta razão, a proteína LepA388 foi a mais estudada. A clonagem de três porções da proteína (LepA388P, LepA388NR e LepA388F) para expressão heteróloga resultou em proteínas recombinantes insolúveis e, considerando a riqueza em resíduos de cisteína presente em sua estrutura, não foi possível renaturá-las adequadamente. Diante dos obstáculos encontrados, apenas a porção contendo a sequência apresentada pelo fago (LepA388P) foi utilizada para obtenção de antissoros em camundongos, os quais apresentaram altos títulos, demonstrando a alta imunogenicidade da proteína LepA388P. O reconhecimento de proteínas nativas da família paráloga DUF_61 em extratos de diferentes sorovares de Leptospira não foi observado, assim como sua expressão in vitro a partir de bactérias em diferentes condições de cultivo. Estudos adicionais sobre a expressão in vivo e funções dos membros desta família são necessários para uma compreensão mais ampla de seu papel na biologia de leptospiras e, possivelmente, na patogênese da leptospirose. / Leptospirosis is an emerging infectious disease whose etiologic agents are pathogenic species of the genus Leptospira. Pathogenic leptospires have countless specific genes encoding proteins with unknown functions, suggesting that leptospires have unique virulence factors. Bacterial adhesins are important virulence factors and so the identification of conserved adhesins in pathogenic Leptospira species from shotgun phage display libraries, followed by selection (biopanning) in cells and/or extracellular matrix components, can reveal new antigens and strategies for leptospirosis treatment and prevention. Libraries were constructed using fragmented genomic DNA from L. interrogans and pG8SAET phagemid vector. Cloning approaches included blunt-end ligation and techniques based in cohesive-end ligation, such as ORESTES strategy and hairpin linkers. Despite some limitations, cloning by blunt-end ligation was the most efficient for library construction, being adopted for the construction of three libraries on a larger scale. Selection of new possible adhesins was performed by biopanning of the libraries in eukaryotic cells through BRASIL methodology. The first library called BBT1 exhibited approximately 106 total clones, and its biopanning resulted in four proteins fused to phage protein VIII, but none of them were expected to be exposed by the bacteria. Other libraries were built (BBT2 and BBT3) which reached the expected number of clones to obtain a larger genome representation (> 2x107 clones). Since it showed the highest proportion of positive clones, BBT2 was selected to perform a second biopanning, resulting in eleven proteins fused to phage protein VIII and/or signal peptide. In silico analysis revealed three hypothetical proteins, named LepA962, LepA069 and LepA388, that would be exposed or secreted by the bacteria, suggesting a possible adhesin function. The study of LepA388 protein led to the recognition of twelve other similar proteins belonging to a paralogous family that contains a domain called DUF_61, domain of unknown function that is present in proteins shared only among the most virulent pathogenic species of Leptospira. For this reason, the LepA388 protein was the most studied. The cloning of three portions of the protein (LepA388P, LepA388NR and LepA388F) for heterologous expression resulted in insoluble recombinant proteins, and given the presence of many cysteine residues in its structure, it was not possible to renature them appropriately. In face of the imposed obstacles, only the portion containing the sequence presented by the bacteriophage (LepA388P) was used to obtain antisera in mice, which showed high titers, demonstrating the high immunogenicity of the protein LepA388P. Recognition of native DUF_61 paralogous family proteins in extracts from distinct Leptospira serovars was not observed, as well as its in vitro expression from bacteria cultured in different conditions. Additional studies on the in vivo expression and functions of members of this family are needed for a broader understanding of their role in leptospiral biology and possibly in the pathogenesis of leptospirosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados. / The dimorphic fungus Sporothrix schenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a deep mycosis that presents different clinical manifestations. The diverse manifestations of this and other infections can be related the host immunity, virulence factors or different genotypes of the pathogen. Previous data of our group demonstrated that differences in the expression of adhesins to fibronectin are directly related to the virulence of the different strains of S. schenckii. In the present work we have evaluated the morphological, biochemical and genotypic characteristics of twelve strains of S. schenckii (isolated from human and cat cases of sporotrichosis and from environment) from different geographic regions that present distinct virulence levels. The mycelium and yeast phases of each strain were morphologically analyzed. The strains has presented the typical morphology, with thin and septated hyphae. The conidia exhibited obovoidal or ovoidal elongated form. The yeast phase presented the ovoid or elongated cell form. Furthermore, we have verified the adhesins expression to fibronectin, to laminin, to gp70 antigen and to the antigenic bands pattern of all protein extracts, recognized by patients or infected mice sera antibodies. For this, the proteins were extracted from the surface of each strain yeast phase and assayed by Western blot technique. We have observed that the most virulent strains of S. schenckii expressed more adhesins to fibronectin and to laminina than less virulent strains. The presence of the gp70 was confirmed in ten isolates of twelve. Just strains isolated from infected cats did not present this glycoprotein. The antigenic bands pattern was variable between the different extracts, with no clear correlation with origin or geographical distribution of the isolates of S. schenckii. In order to cross phenotypic and genotypic data we have sequenced the calmodulin loci (CAL) and the Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) in order to check if there was differences between the strains studied. In this analysis we found that this strains are divided in two species, S. schenckii and S. brasiliensis, again with no correlation with the geographical distribution. Our study reinforces the hypothesis on the correlation between adhesins expression pattern and virulence levels with no connection among geographical distribution or genotype of the different strains of S. schenckii.

Os Staphylococcus spp., são bactérias Gram positivas com importância clinica, as quais são capazes de causar uma ampla variedade de doenças em seres humanos e animais. O uso excessivo de antimicrobianos pode selecionar bactérias resistentes aos antimicrobianos de uso comum em Veterinária, o que representa uma grande ameaça para a saúde animal, e a saúde publica no mundo inteiro. Apesar de sua importância clinica, existe um conhecimento limitado sobre a patogênese das infecções estafilococicas em animais de estimação, e os fatores de virulência bacterianos específicos envolvidos em estas doenças. A Infecção estafilocócica iniciasse a partir da adesão do micro-organismo ao tecido do hospedeiro. A adesão é favorecida pela presença de fatores de virulência conhecidos como adesinas, que estão agrupadas em uma família conhecidas como as microbial surface components recognising adhesive matrix molecules (MSCRAMM). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, 118 estirpes de Staphylococcus spp., foram identificadas, 111 (94.07%), estirpes em cães, e 7 (5.93%) em gatos. Entre os Staphylococcus, sete espécies diferentes foram isoladas: 82 (69.49%) Staphylococcus pseudointermedius, 19 (16.10%) Staphylococcus epidermidis, 7 (5.93%) Staphylococcus xylosus, 4 (3.39%) Staphylococcus chromogenes, 3 (2.54%) Staphylococcus spp., 2 (1.69%) Staphylococcus aureus, 1 (0.85%) Staphylococcus schleiferi. A susceptibilidade a 26 agentes antimicrobianos foi determinada em todos os isolados. A pesquisa pelas MSCRAMM e o gene formador de biofilme nas estirpes de Staphylococcus spp., foi realizada usando a reação em cadeia da polimerasa (PCR), foram usados diferentes pares de primers para detectar os genes que codificam para a proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebpS), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (FnbA), proteína B ligadora de fibronectina (FnbB), e proteína associada a formação de biofilme (Bap). A resistência apresentada pelas estirpes isoladas aos diversos antimicrobianos foi observada com frequência, a percentagem de resistência geral das cepas de Staphylococcus spp isoladas foi: 54,32% para eritromicina, 40,79% para clindamicina, e 29,91% para norfloxacina. A susceptibilidade a oxacilina tambem foi testada, o 85,96% das estirpes isoladas foram susceptíveis. Todos os genes foram identificados com exceção do Bap e EbpS, o gene mais frequentemente isolado foi o Eno (89,9%), a associação entre os genes Eno/Fib/FnbA e Eno/FnbB foram também detectadas. Nossos resultados evidenciaram que os membros do gênero Staphylococcus apresentam frequentemente resistência in vitro aos antimicrobianos usados comumente. É necessário fazer um uso criterioso de antibióticos em animais de estimação em Medicina Veterinária. A informação sobre o assunto pode permitir o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para o tratamento e controle das infeções causadas por Staphylococcus spp., em pequenos animais / Staphylococcus spp., are clinically important Gram-positive bacteria that are capable of causing a wide variety of diseases in humans and animals. The overuse of antimicrobials can select resistant bacteria strains, that represents a major threat to animal and public health worldwide. Despite its clinical importance, there is only very limited knowledge about the pathogenesis of staphylococcal infections in small animals, and the specific bacterial virulence factors involved in causing these diseases. Staphylococcal infection initiates from the adhesion of the microorganism to the tissue of the host. Adhesion is favoured by the presence of virulence factors known as adhesins, which are grouped in a family known as the microbial surface components recognising adhesive matrix molecules (MSCRAMM). After isolation and identification of microorganisms, 118 Staphylococcus strains were identified, 111 (94.07%) strains from canine and 7 (5.93%) from feline origin. Among Staphylococcus, seven different species were isolated: 82 (69.49%) Staphylococcus pseudointermedius, 19 (16.10%) Staphylococcus epidermidis, 7 (5.93%) Staphylococcus xylosus, 4 (3.39%) Staphylococcus chromogenes, 3 (2.54%) Staphylococcus spp., 2 (1.69%) Staphylococcus aureus, 1 (0.85%) Staphylococcus schleiferi. The susceptibility to 26 antimicrobials was determined in all the isolates. The search for MSCRAMM and biofilm-encoding genes in the strains of Staphylococcus spp. was performed using a polymerase chain reaction (PCR). Primers were used to detect the genes encoding for collagen-binding protein (cna), laminin-binding protein (eno), elastin-binding protein (ebpS), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA) and fibronectin-binding protein B (fnbB) and biofilm formation-encoding genes (bap). Resistance of isolates to antibiotics was frequently observed, the percentage of resistance in the general Staphylococcus strains was: 54,32% to erythromycin, 40,79% to clindamycin, and 29,91% to norfloxacin. Susceptibility to oxacilin was also tested, 85,96%) % of the isolates were susceptible. All genes were detected except for ebpS and bap. The most frequently detected gene in both species was eno (89, 9%). Association of genes Eno/Fib/FnbA and Eno/FnbB were also detected. Our results highligthed that members of the Staphylococcus genus often exhibit in vitro resistance to commonly used antimicrobials. Its necessary a judicious use of antibiotics in small animals Veterinary Medicine. Such information on the subject allows the development of more efficient strategies for treatment and control of Staphylococcus infection in small animals