Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O sorogrupo O26 de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) atípica é um dos sorogrupos mais frequentes implicados na diarréia infantil, sendo um sorogrupo muito comum também em amostras de E. coli enterohemorrágica (EHEC). O sorotipo mais frequente dentro do sorogrupo O26 tanto em amostras de EPEC quanto em amostras de EHEC é a O26:H11. Num recente estudo, amostras de EPEC atípica O26:H11 isoladas de crianças com diarréia apresentaram um padrão de adesão localizado (AL), porém eram desprovidas da fímbria BFP responsável pelo fenótipo AL das EPEC típicas. Uma dessas amostras, E. coli 22, foi escolhida para caracterização de seus determinantes genéticos. Foi construída uma biblioteca genômica da amostra 22 na E. coli DH5α e identificado um clone cosmídeo denominado pV-B-6, aderente a células HeLa. O clone pV-B-6 exibiu um padrão de adesão difusa (AD) sobre as células epiteliais, diferente da formação de microcolônias presentes na adesão AL apresentada pela amostra 22. O cosmídio pV-B-6 foi submetido a mutagênese utilizando o transposon mini-Tn10::kan e identificado um mutante não aderente (pV-B-6-Tn). Um fragmento de 2,3 kb EcoRI-HindIII contendo 1 kb do mini-Tn10 foi clonado, sendo identificado um gene, ldaH, que possuía 73% de identidade com a subunidade fimbrial faeH da de fímbria K88 ETEC. Essa região foi denominada de “locus for diffuse adherence” (lda). O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a adesina codificada pelo locus lda, a qual é responsável por conferir o padrão AD a células HEp-2 na amostra pV-B-6. A análise em SDS-PAGE de extratos parcialmente purificados das amostras 22 e pV-B-6 mostrou uma banda protéica de aproximadamente 25 kDa, que estava ausente nos extratos do mutante pV-B-6-Tn. A proteína de 25 kDa foi cortada do gel, sendo determinado o sequenciamento da região amino-terminal. A sequência de aminoácidos correspondeu ‡ forma madura de LdaG, a principal subunidade estrutural da adesina. A expressão de Lda foi induzida em meio ágar MacConkey a 37o C. Para demonstrar que a adesina LDA era a responsável pelo padrão AD a células HEp-2, foi produzido um anti-soro LdaG em coelho. A especificidade do soro anti-LdaG foi determinada pela reação de “Imuno blot”. Apenas a proteína de 25 kDa foi reconhecida pelo soro imune, apresentando uma reação fortemente positiva com a amostra selvagem E. coli 22 e com o clone pV-B-6. Nenhuma reação do soro anti-LdaG foi observada no mutante, demonstrando, assim, a especificidade desse soro. Ensaios de inibição de adesão revelaram que o anti-soro LdaG reconheceu os epítopos da adesina responsáveis pela fenótipo AD, visto que foi capaz de inibir totalmente a adesão do clone pV-B-6. A imunomarcação com o anti-soro LdaG identificou na amostra 22 uma matriz de superfície amorfa sem nenhuma aparência de estrutura fimbrial. Quando observado em aumento maior, verificou-se a presença de estruturas fibrilares muito finas formando estruturas semelhantes a uma malha. Em contrapartida, nenhuma marcação foi observada no mutante LDA1. Foi determinada a incidência do gene ldaH em 65 amostras de EPEC atípica, isoladas em diferentes cidades brasileiras de crianças com diarreia aguda e de controles e pertencentes a 34 diferentes sorogrupos. Nenhuma dessas 65 amostras produtoras do padrão ALL em ensaios de 6 horas apresentou a sequência ldaH. Também foram estudadas 13 amostras de EPEC atípica que pertenciam aos sorogrupos O26, O55 e O111. O gene ldaH foi encontrado em quatro amostras, todas do sorogrupo O26 e que apresentavam o padrão AL em ensaios de três horas. No entanto, tanto os experimentos de PCR para amplificação do gene estrutural ldaG, como os experimentos de “Imuno blot” utilizando o anti-soro LdaG não revelaram a proteína de 25 KDa. Ensaios de inibição de adesão e imunofluorescência com soro antiK88 foram realizados com o intuito de investigar a relação antigênica entre as adesinas LDA e K88. Os resultados mostraram que ambas as adesinas são antigenicamente distintas, uma vez, que o soro anti-K88 não inibiu a AD e nem reconheceu qualquer estrutura presente na superfície da amostra pV-B-6. Neste estudo foi avaliado o papel da adesina LDA na virulência bacteriana, utilizando o modelo do camundongo tratado com estreptomicina e comparando a amostra selvagem 22 com a isogênica apresentando deleção do gene ldaG. Os resultados obtidos mostraram que aparentemente, a adesina LDA est· envolvida no processo de colonização, uma vez que a amostra selvagem 22 aderiu e colonizou mais eficientemente o ceco de camundongos C57BL/6J do que a amostra 22 ∆ldaG Concluindo, nossos resultados levaram a identificação e caracterização da adesina LDA responsável pela aderência difusa a células HEp-2. LDA È uma adesina afimbrial que contém uma subunidade principal, LdaG, cuja expressão é induzida em ágar MacConkey a 37o C. Estudos futuros são necessários para caracterizar melhor o papel da adesina LDA na virulência bacteriana. / The O26 serogroup of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one of the most frequently implicated in infant diarrhea and is also common among enterohemorrhagic E. coli (EHEC) strains. The most common O26 strains belong to EPEC/EHEC serotype O26:H11. In a previous report, atypical EPEC strains O26:H11 isolated from children with diarrhea exhibited a localized adherence (LA) pattern within 3 hours, but do not harbor the BFP fimbriae correlated with the LA phenotype of typical EPEC. One isolate, E. coli 22 was used to characterize its genetic determinants. A genomic cosmid library of E. coli 22 was generated in E. coli K12 and the resulting clones were screened for LA adherence to HEp-2 cells. One cosmid clone, pV-B-6, exhibited adherence in a diffuse pattern over the entire epithelial cell rather than the LA microcolony formation seen with E. coli 22. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pV-B-6 responsible for the adhesive phenotype. One isolate tested negative for adherence (pV-B-6-Tn) was chosen for further analysis. DNA sequencing of a subclone of pV-B-6 revealed an open reading frame, ldaH, whose predicted protein product shares 73% amino acid identity with that of the E. coli K88 fimbrial gene faeH. This region was named the locus for diffuse adherence (lda). The aim of this study was to characterize the adhesin encoded by the lda locus that is responsible for mediating diffuse adherence to HEp-2 cells. SDS-PAGE of whole-cell cell lysates from E. coli 22 and pV-B-6 showed a broad band with an apparent molecular mass of 25 kDa, which was absent in the pV-B-6-Tn extracts. The 25-KDa band was excised from the gel, and its N-terminal amino acid sequence determined. The sequence corresponds to the mature form of LdaG, the major structural subunit. The expression of LdaG is induced on MacConkey agar at 37o C. To provide further evidence that the LDA adhesin was responsible for the diffuse adherence seen on HEp-2 cells, we raised polyclonal rabbit antiserum against the major structural subunit LdaG. Imuno blot analysis 17 showed that the antiserum recognized the 25-kDa band present in wildtype E. coli 22 and pV-B-6, but not the pV-B-6-Tn mutant. Treatment of pV-B- 6 with the antiserum completed inhibited diffuse adherence of pV-B-6 to the HEp-2 cells. Immunogold labeling with LdaG antiserum identified an amorphous surface matrix with no obvious fimbrial structure. At higher magnification, very fine wiry fibrils forming mesh-like structures could be visualized. To determine whether the lda locus was specific to our O26:H11 strain or if it is present in other E. coli strains, we performed colony blots and HEp-2 adherence on a collection of 65 atypical EPEC strains representing 34 O serogroups. Most (61.5%) of strains were positive for HEp-2 localized-like adherence assay and all strains were ldaH probe negative. We also tested 13 atypical EPEC strains, which belonged to Dr. Luiz R. Trabulsi and ldaH was found in four O26 LA positive strains. These strains were tested with an ldaG gene probe, but were negative. By using a K88 antiserum, it was possible to demonstrate different antigenic determinants, between LDA and K88 adhesins. A streptomycin-treated mouse model was used to compare the intestinal colonization capacity of E. coli 22 strain with that of its ∆ldaG derivative (LDA1). The results showed that E. coli 22 adheres and colonizes the cecum of C57BL/6J mice more efficiently than the LDA1. In conclusion, we were able to characterize the LDA adhesin responsible for diffuse adherence to HEp-2 cells. LDA is an afimbrial adhesin that contains a major subunit, LdaG, whose expression is induced on MacConkey agar at 37o C. Additional work is needed to characterize the role in virulence of the LDA adhesin. / FAPESP: 01/03525-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_MelinaAparecida_M.pdf: 3889960 bytes, checksum: 3e92b071b7e108ebb8bff09fe751b180 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O Resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The Abstract is available with the full electronic digital document / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Conceicao_RogerioArcuri1983-_D.pdf: 4676987 bytes, checksum: 96e3babbbb52c358f5daca2c8166f056 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Estudos preliminares sobre adesão e invasão mostraram que 100% de 49 amostras de Escherichia coli associada à sepse humana (SEPEC) foram capazes de aderir e invadir células Vero (Rim de macaco verde africano) e Huvec (Veia umbilical humana). Em análise genotípica, foi observada uma alta prevalência dos genes fimH (98,0%) que codificam para a adesina da fimbria de tipo 1 (F1). No entanto, as cepas analisadas aderiram tanto na presença quanto na ausência de ?-D-manopiranosideo, um inibidor da adesão mediada pela F1. Por esse motivo foram analisadas as proteínas de membrana externa de SEPEC, com o objetivo de se avaliar potenciais fatores adesão e invasão dessas cepas. Por técnicas de proteômica, foram identificadas três proteínas de SEPEC com afinidade a glicoproteínas celulares: OmpA (Proteína de membrana A); FimA (Subunidade maior da fimbria do tipo 1) e YdeR (Subunidade menor da fimbria do tipo 9 - F9). Esses dados foram coerentes com a análise genotípica das amostras SEPEC, pois foi observada uma alta porcentagem dos genes que codificam para as três proteínas descritas anteriormente, sendo que 100% das amostras foram ompA+, 98,0% foram fimA+ e 100% foram ydeR+. Os ensaios de adesão e invasão de SEPEC (OmpA+/ F1+) em células Vero e Huvec mostraram que ?-D-manopiranosideo e GlcNAc, quando atuando juntos, agem como potentes inibidores da adesão e invasão, sugerindo que essas moléculas poderiam estar ocupando os sítios de ligação a carboidratos das duas adesinas F1 e/ou OmpA, respectivamente. Para confirmar essa hipótese, mutantes nulos para ?fimA (OmpA+/ F1-) e ?ompA (OmpA-/F1+) foram construídos, e os resultados de adesão e invasão bacteriana foram similares aos obtidos na presença dos inibidores: ?-D-manopiranosideo e GlcNAc. Mutante nulo para a proteína YdeR da fimbria F9 (OmpA+/ F1+), mostrou significativa redução da adesão e invasão bacteriana em células Vero e Huvec (p ? 0,05) somente na presença dos inibidores da adesão mediada por F1 e OmpA: ?-D-manopiranosideo e GlcNAc, respectivamente. Esses dados sugerem que F9 também contribui para a adesão e invasão de SEPEC. Juntos, nossos dados demonstram que os processos de adesão e invasão de SEPEC são dependentes de OmpA, F1 e F9, as quais podem ser complementares, e devem atuar sinergicamente para a adesão e invasão de SEPEC / Abstract: Our preliminary studies about bacterial adhesion and invasion showed 100% of 49 strains of human sepsis-associated Escherichia coli (SEPEC) were able to adhere and invade Vero (African green monkey kidney) and HUVEC (human umbilical vein) cells. In genotypic analysis, high prevalence of fimH (98.0%), gene encoding for the type 1 fimbrial adhesin was observed. However, all the strains analyzed were able to adhere and invade these cellular lineages both in the presence and absence of the type 1 fimbriae adherence-inhibitor ?-D-mannopiranoside. Consequently, the outer membrane proteins of SEPEC were analyzed in order to find potential adhesion and invasion factors expressed by these strains. Through proteomic techniques, three proteins with affinity to cellular glycoproteins were identified: OmpA (Membrane Protein A); FimA (major subunit of type 1 fimbriae - F1) and YdeR (minor subunit of type 9 fimbriae - F9). These data were consistent with the genotypic analysis of SEPEC strains because a high percentage of the genes encoding these three proteins was observed, being that ompA+ (100%) fimA+ (98%) and ydeR+ (100%). Assays of adhesion and invasion of SEPEC (OmpA+ / F1+) in Vero and HUVEC cells showed that ?-D-manopiranosideo and GlcNAc, when acting together, act as potent inhibitors of adhesion and invasion, suggesting that these molecules could be occupying sites of carbohydrate-binding displayed by adhesins from both F1 and/or OmpA, respectively. To confirm this hypothesis, null mutants ?fimA (OmpA+/F1-) and ?ompA (OmpA-/F1+) were constructed, and the phenotypic results of bacterial adhesion and invasion were similar to those obtained in the presence of inhibitors ?-D-mannopiranoside and GlcNAc. The mutant ?ydeR (OmpA+ / F1+), null mutant for YdeR protein of F9 fimbriae, showed a significant reduction in bacterial adhesion and invasion in Vero and HUVEC (p ? 0.05) just in the presence of inhibitors of cell adhesion mediated by F1 and OmpA. These data suggest that F9 also can contribute to the adhesion and invasion of SEPEC in Vero and HUVEC cells. Hold together, our data demonstrated that adhesion and invasion of SEPEC are OmpA, F1 and F9 dependents, which can be complementary and express synergistic activity leading to enhancing the ability of adhesion and invasion in SEPEC strains / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular