Orientadores: Francisco Carlos Groppo, Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-12T19:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cogo_Karina_D.pdf: 3355648 bytes, checksum: d8afd799c6d162cda6cbb9bad9d225a5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O uso do cigarro tem sido associado com a progressão da periodontite bem como com a redução da resposta à terapia aplicada a essa doença. Porphyromonas gingivalis é um importante colonizador do biofilme subgengival além de ser um dos principais patógenos envolvidos no estabelecimento e progressão da doença periodontal. No entanto, os possíveis efeitos dos principais derivados do cigarro sobre P. gingivalis ainda não foram totalmente investigados. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da nicotina e cotinina sobre a expressão de proteínas e sobre a capacidade de adesão e invasão celular de P. gingivalis. A fim de avaliar a expressão de proteínas, culturas de P. gingivalis W83 foram expostas à nicotina e cotinina nas concentrações de 6 e 600µg/mL, as proteínas foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (12.5% SDS-PAGE) e identificadas por LC-MS/MS. Os géis e suas corridas eletroforéticas foram feitas em triplicatas e a detecção de proteínas nos mesmos foi feita através de coloração com corante Coomassie. Proteínas diferentemente expressas foram digeridas com tripsina e as amostras de peptídeos sequenciadas utilizando um sistema Q-TOF API LC-MS/MS. A busca MS/MS foi realizada utilizando os bancos de dados MSDB e NCBI através do programa Mascot. Para examinar a capacidade de adesão e invasão de P. gingivalis, monocamadas de células KB e culturas de P. gingivalis ATCC 33277 foram expostas às concentrações de 0.1, 10 e 100 µg/mL de nicotina e cotinina. As células epiteliais foram incubadas por 24 h enquanto P. gingivalis foi exposta a essas substâncias até atingir a fase logarítmica. Após o período de incubação, P. gingivalis foi submetida aos ensaios de adesão e invasão às células KB. O número de bactérias associadas às células foi obtido através de contagem de unidades formadoras de colônia. Os resultados obtidos da análise expressão de proteínas mostraram que a adição de nicotina e cotinina promoveram alterações no proteoma de P. gingivalis. Entre os ± 430 spots de proteínas reproduzíveis detectados em cada gel, 20 proteínas foram menos expressas e 42 foram mais expressas em pelo menos um dos tratamentos (p<0.05; ANOVA - Tukey). Entre as proteínas identificadas, muitas estavam envolvidas em processos como produção de energia celular, síntese de proteínas, estresse oxidativo, virulência, transporte, etc. Em relação aos resultados obtidos nos ensaios de adesão e invasão, foi evidenciado que, quando as células epiteliais foram inoculadas com nicotina e cotinina, nenhuma diferença significativa na colonização de P. gingivalis foi encontrada. Quando P. gingivalis foi exposta à maior concentração de cotinina, sua capacidade de adesão e invasão às células epiteliais aumentou de forma expressiva (p<0.05; ANOVA - Tukey). No entanto, a nicotina e as outras concentrações de cotinina testadas não alteraram a capacidade de colonização. Esses achados indicam que a nicotina e a cotinina podem afetar a expressão de proteínas de P. gingivalis. Ainda, a cotinina pode alterar positivamente a eficiência de adesão e invasão de P. gingivalis. / Abstract: Cigarette smoking is associated with the development of periodontitis and the decreased response to periodontal therapy. P. gingivalis is an important colonizer of the subgingival biofilm and is one of the major pathogens involved in the initiation and progression of periodontal disease. However, the possible effects of major cigarette's derivatives on P. gingivalis were not fully investigated. Thus, the purpose of the present study was to evaluate the effects of nicotine and cotinine on the protein expression and cellular adhesion and invasion abilities of P. gingivalis. To evaluate protein expression, P. gingivalis W83 cultures were exposed to nicotine and cotinine 6 and 600µg/mL concentrations, the proteins were extracted, separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (12.5% PAGE) and identified with LC-MS/MS. The gels were run in triplicates and detection of proteins was obtained by staining the gels with Coomassie blue. Proteins differentially expressed were digested with trypsin, and the peptide samples sequenced using a Q-TOF API LC-MS/MS system. The MS/MS was searched against the MSDB and NCBI databank using Mascot program. In order to assess P. gingivalis adhesion and invasion abilities, KB cells monolayers and P. gingivalis ATCC 33277 cultures were exposed to 0.1, 10 and 100 µg/mL nicotine and cotinine concentrations. The epithelial cells were incubated for 24 h while P. gingivalis was exposed to these substances until early logarithmic phase. After incubation period, P. gingivalis were submitted to assays to evaluate adhesion to and invasion of KB cells. The number of bacteria associated with these cells was assessed by counting the colony-forming unities. The results from protein expression analyses showed that addition of nicotine and cotinine promoted alterations in proteome profile of P. gingivalis. Among ± 430 protein spots reproducibly detected on each gel, 20 protein spots were downregulated, and 42 were upregulated at least in one treatment (p<0.05; ANOVA - Tukey test). The identified proteins are involved in several processes, i.e. energy production, protein synthesis, oxidative stress, virulence, transport and binding activities. Data obtained from adhesion and invasion assays evidenced that epithelial cells inoculated with nicotine and cotinine did not show any significant differences in P. gingivalis colonization. When P. gingivalis was exposed to the higher concentration of cotinine, adherence and invasion of this bacterium to the epithelial cells markedly increased (p<0.05; ANOVA - Tukey test). However, nicotine and the other concentrations of cotinine did not alter the colonization ability. These findings indicate that nicotine and cotinine may affect P. gingivalis protein expression. In addition, cotinine may alter positively P. gingivalis adhesion and invasion efficiencies. / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-07T13:37:49Z No. of bitstreams: 4 Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 01.pdf: 17508857 bytes, checksum: 1d04cb16c6e33e54fe0304cecb5e491b (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 02.pdf: 14162361 bytes, checksum: b19921eb48893ef7a1aa4ddc2a2e1553 (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 03.pdf: 17178000 bytes, checksum: aaf5cfd215078190a7900eafd1e47790 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-07T15:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 4 Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 01.pdf: 17508857 bytes, checksum: 1d04cb16c6e33e54fe0304cecb5e491b (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 02.pdf: 14162361 bytes, checksum: b19921eb48893ef7a1aa4ddc2a2e1553 (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 03.pdf: 17178000 bytes, checksum: aaf5cfd215078190a7900eafd1e47790 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-07T15:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 4 Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 01.pdf: 17508857 bytes, checksum: 1d04cb16c6e33e54fe0304cecb5e491b (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 02.pdf: 14162361 bytes, checksum: b19921eb48893ef7a1aa4ddc2a2e1553 (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 03.pdf: 17178000 bytes, checksum: aaf5cfd215078190a7900eafd1e47790 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Iron (Fe) is an indispensable metal for most biological systems and is a target of competition in host-pathogen interactions. In humans, most Fe is complexed to the cofactor heme, present in hemoglobin, a molecule that is exploited by pathogens as an iron source. Paracoccidioides spp., a complex of thermodymorphic pathogenic fungi, are the etiological agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis endemic in Latin America. Paracoccidioides spp. are able to use hemoglobin in a receptor(PbRbt5)-mediated process. However experimental evidence points to the existence of a complex system with the presence of other proteins. In the present work, we demonstrated the similarity between PAAG_02225 (PbPga7), from Paracoccidioides lutzii, and the sequence of the heme/hemoglobin receptor Pga7 from Candida albicans, and expressed PbPga7 in Escherichia coli. Due to the presence of rare codons in P. lutzii sequence, compared to the codons preferably used by Escherichia coli, chemical synthesis of the gene was employed. The expression of PbPga7 protein opens perspectives for PbPga7 characterization. In addition, nanoUPLC-MSE was employed to analyze P. lutzii cell wall proteome. We observed that the treatment of fungus with hemoglobin promotes induction of potential adhesins and defense-related enzymes against reactive oxygen species. These data indicate that these proteins may be important for the pathogen to access hemoglobin by adhering and lysing erythrocytes, besides counteracting the toxicity generated by heme/hemoglobin released from erythrocytes, allowing the uptake and use of these molecules. The results obtained in the present work reinforce the complexity of the interaction event between pathogen and host and, in addition, contribute to broaden the understanding of the biology of Paracoccidioides spp. / O Ferro (Fe) é um metal indispensável para a maioria dos sistemas biológicos e é alvo de competição em interações patógeno-hospedeiro. Em humanos, a maioria do Fe encontra-se complexada ao cofator heme, presente na hemoglobina, uma molécula que é explorada por patógenos como uma fonte de Fe. Paracoccidioides spp., um complexo de fungos patogênicos termodimórifocos, são agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica endêmica na América Latina. Paracoccidioides spp. é hábil em utilizar hemoglobina por um processo mediado por receptor (PbRbt5). Contudo, evidências experimentais apontam para a existência de um sistema complexo com a presença de outras proteínas. No presente trabalho, foi demonstrada a similaridade de PAAG_02225 (PbPga7), de Paracoccidioides lutzii, com a sequência do receptor de heme/hemoglobina Pga7 de Candida albicans. A expressão heteróloga de PbPga7 foi realizada em Escherichia coli. Devido a presença de códons raros na sequência de P. lutzii, comparados aos códons utilizados preferencialmente por E. coli, a síntese química do gene foi empregada. A expressão da proteína PbPga7 abre perspectivas para estudos de caracterização da mesma. Adicionalmente, nanoUPLC-MSE foi utilizada para analisar o proteoma de parede celular de P. lutzii. Observou-se que o tratamento do fungo com hemoglobina promove a regulação positiva de potenciais adesinas e enzimas relacionadas com a defesa contra espécies reativas de oxigênio. Estes dados indicam que estas proteínas podem ser importantes para que o patógeno possa acessar a hemoglobina, aderindo e lisando eritrócitos, além de contrapor a toxicidade gerada pelo heme/hemoglobina liberados, permitindo a captação e utilização dessas moléculas. Os resultados obtidos no presente trabalho reiteram a complexidade do evento de interação entre patógeno e hospedeiro e, adicionalmente, contribuem para a ampliação do entendimento da biologia de Paracoccidioides spp.

Cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) estão entre os patógenos mais freqüentemente envolvidos em casos de diarréia. Este patotipo é subdividido em EPEC típicas e atípicas, sendo que as típicas possuem o gene eae (EPEC attaching and effacing) e o plasmídeo EAF (EPEC adherence fator), e as atípicas albergam somente o gene eae. A principal característica de sua patogênese é a formação de uma lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E), que resulta da adesão íntima da bactéria ao enterócito. A adesão é uma etapa crítica na patogênese bacteriana, sendo o primeiro pré-requisito para que as E. coli colonizem com sucesso a mucosa do hospedeiro. A ligação da bactéria a um ou mais componentes teciduais da matriz extracelular como colágeno I e IV, laminina, fibronectinas celular e plasmática são indícios de que essas moléculas estão sendo usadas como substrato de adesão e colonização do hospedeiro pela bactéria patogênica. Adesinas com capacidade de interagir com componentes da matriz extracelular já foram identificadas em bactérias patogênicas, no entanto, ainda não foi caracterizada nenhuma proteína de EPEC atípica com essa capacidade de adesão. Essa propriedade foi evidenciada em um isolado de EPEC atípica durante pesquisas em nosso laboratório e neste trabalho visamos identificar e caracterizar a(s) proteína(s) envolvida(s) nesta habilidade adesiva. As proteínas possivelmente envolvidas apresentam massas moleculares relativas de 107, 44 e 35 kDa e a pré-incubação do isolado 2103 com componentes de matriz extracelular provoca uma variação no seu padrão de adesão e influencia o número de bactérias aderidas a células epiteliais. No entanto, como esse patotipo é muito heterogêneo essa característica não pode ser extrapolada para todos os isolados dessa categoria. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) has been a leading cause of childhood diarrhea in developing countries. The main mechanism of atypical EPEC pathogenesis is a lesion called attaching and effacing (A/E), which is characterized by intimate adherence of the bacteria to the intestinal epithelium and destruction of microvillus. Nevertheless, it represents a heterogeneous group and other virulence factors may be involved in atypical EPEC pathogenesis. Previously, we have identified one isolate of atypical EPEC, serotype O26:H11, which secretes proteins that interact with ECM macromolecules. The interactions between pathogenic bacteria and ECM molecules such as fibronectin, laminin and collagen may play an important role in the bacterium adherence to and invasion of host cells. Adhesion is critical for successful E. coli colonization of gastrointestinal tract and is mediated by adhesins. The aim of this study is to identify and characterize putative adhesins that may contribute to the binding of the isolate of atypical EPEC to extracellular matrix components. The supernatant of the atypical EPEC isolate was submitted to a solid phase binding assay with matrigel (a mouse basement membrane composed mainly of laminin, collagen IV and fibronectin), the adhered proteins were stripped from the wells, separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and submitted to immunoblotting assay. Three major proteins of apparent molecular weights of 107, 44 e 35 kDa were recognized by the anti-proteins polyclonal serum (produced in rabbit immunized with the isolate\'s supernatant) through immunoblotting assay. Besides, we observed that in the presence of ECM components the isolate clearly changes its adherence pattern of the isolate to HEp-2 cells, and the number of adhered bacteria to epithelial cells. The atypical EPEC do not share a unique pattern of virulence, suggesting that many virulence factors may contribute to the pathogenesis. The identification of proteins involved in the adhesion with extracellular matrix components in one isolate of this category of diarrheagenic E. coli confirms the heterogeneity among the atypical EPEC.

Cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) estão entre os patógenos mais freqüentemente envolvidos em casos de diarréia. Este patotipo é subdividido em EPEC típicas e atípicas, sendo que as típicas possuem o gene eae (EPEC attaching and effacing) e o plasmídeo EAF (EPEC adherence fator), e as atípicas albergam somente o gene eae. A principal característica de sua patogênese é a formação de uma lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E), que resulta da adesão íntima da bactéria ao enterócito. A adesão é uma etapa crítica na patogênese bacteriana, sendo o primeiro pré-requisito para que as E. coli colonizem com sucesso a mucosa do hospedeiro. A ligação da bactéria a um ou mais componentes teciduais da matriz extracelular como colágeno I e IV, laminina, fibronectinas celular e plasmática são indícios de que essas moléculas estão sendo usadas como substrato de adesão e colonização do hospedeiro pela bactéria patogênica. Adesinas com capacidade de interagir com componentes da matriz extracelular já foram identificadas em bactérias patogênicas, no entanto, ainda não foi caracterizada nenhuma proteína de EPEC atípica com essa capacidade de adesão. Essa propriedade foi evidenciada em um isolado de EPEC atípica durante pesquisas em nosso laboratório e neste trabalho visamos identificar e caracterizar a(s) proteína(s) envolvida(s) nesta habilidade adesiva. As proteínas possivelmente envolvidas apresentam massas moleculares relativas de 107, 44 e 35 kDa e a pré-incubação do isolado 2103 com componentes de matriz extracelular provoca uma variação no seu padrão de adesão e influencia o número de bactérias aderidas a células epiteliais. No entanto, como esse patotipo é muito heterogêneo essa característica não pode ser extrapolada para todos os isolados dessa categoria. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) has been a leading cause of childhood diarrhea in developing countries. The main mechanism of atypical EPEC pathogenesis is a lesion called attaching and effacing (A/E), which is characterized by intimate adherence of the bacteria to the intestinal epithelium and destruction of microvillus. Nevertheless, it represents a heterogeneous group and other virulence factors may be involved in atypical EPEC pathogenesis. Previously, we have identified one isolate of atypical EPEC, serotype O26:H11, which secretes proteins that interact with ECM macromolecules. The interactions between pathogenic bacteria and ECM molecules such as fibronectin, laminin and collagen may play an important role in the bacterium adherence to and invasion of host cells. Adhesion is critical for successful E. coli colonization of gastrointestinal tract and is mediated by adhesins. The aim of this study is to identify and characterize putative adhesins that may contribute to the binding of the isolate of atypical EPEC to extracellular matrix components. The supernatant of the atypical EPEC isolate was submitted to a solid phase binding assay with matrigel (a mouse basement membrane composed mainly of laminin, collagen IV and fibronectin), the adhered proteins were stripped from the wells, separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and submitted to immunoblotting assay. Three major proteins of apparent molecular weights of 107, 44 e 35 kDa were recognized by the anti-proteins polyclonal serum (produced in rabbit immunized with the isolate\'s supernatant) through immunoblotting assay. Besides, we observed that in the presence of ECM components the isolate clearly changes its adherence pattern of the isolate to HEp-2 cells, and the number of adhered bacteria to epithelial cells. The atypical EPEC do not share a unique pattern of virulence, suggesting that many virulence factors may contribute to the pathogenesis. The identification of proteins involved in the adhesion with extracellular matrix components in one isolate of this category of diarrheagenic E. coli confirms the heterogeneity among the atypical EPEC.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:02:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaSilva_LiviaPilattiMendes_M.pdf: 1602121 bytes, checksum: 21e5b9daa8ce74359c48e82c96cf7a13 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves causam doenças extraintestinais em aves, levando a perdas econômicas consideráveis para a indústria avícola em todo o mundo. Fatores de virulência ainda não conhecidos podem apresentar papéis importantes na patogenicidade, os quais podem ser significativos para o desenvolvimento de medidas de controle de processos infecciosos dessas linhagens. Invasinas permitem que o patógeno invada células hospedeiras, sobrepujando as defesas do hospedeiro, por interagir com receptores específicos na superfície celular. Baseando-se em análises do genoma da linhagem APEC SEPT362, detectou-se a presença de uma provável invasina, homóloga ao gene ychO, ainda não caracterizado, da linhagem E. coli str. K-12 substr. MG1655, sendo seu efeito na patogenicidade estudado. Neste trabalho, a linhagem SEPT362 deficiente para ychO reduziu a taxa de mortalidade em pintos, a adesão a células de fibroblasto de embrião de galinha (FEG), a invasão em células fibroblasto de embrião de galinha (CEC-32), a sobrevivência em macrófagos de aves (HD11), a formação de biofilme e a motilidade. Esses resultados sugerem, pela primeira vez, que o gene ychO codifica para uma invasina e que tem papel na patogenicidade da linhagem APEC SEPT362. Além dos diversos fatores de virulência, o estudo de diferentes tipos de sinais extracelulares que medeiam a comunicação entre bactérias e regulam a expressão gênica abre grandes possibilidades no estudo de mecanismos de patogenicidade e possíveis meios de interferir nos mesmos, transformando organismos patogênicos em organismos não virulentos. Quorum sensing (QS) é um mecanismo dependente da densidade celular bacteriana que as permitem agir como complexos multicelulares, aumentando suas chances de sobrevivência no meio ambiente. O sistema QS autoindutor 2 (AI-2) é um sistema de comunicação universal de bactérias mediado pelo AI-2, produzido pela ação da enzima LuxS. O sistema QS autoindutor 3 (AI-3) é um sistema que pode também mediar a comunicação entre reinos, sendo regulado pela hisitidina quinase QseC. Neste contexto, mutantes para os genes luxS e qseC foram construídos na linhagem SEPT362. A linhagem deficiente para luxS apresentou uma redução significativa na adesão a células FEG, devido a um papel do gene na regulação da fímbria do tipo 1. A linhagem deficiente para qseC teve uma menor taxa de mortalidade em pintos e uma redução significativa na adesão a células FEG, pela falta da fímbria do tipo 1 no mutante / Abstract: Avian pathogenic Escherichia coli strains cause extraintestinal diseases in poultry, leading to substantial economic losses to the poultry industry worldwide. Virulence factors not yet known may play important roles in pathogenicity, which may be significant for measures control development of infectious processes of these strains. Invasins allow the pathogen to invade host cells, overcoming host defenses by interacting with specific cell surface receptors. Based on analysis of APEC SEPT362 strain genome detected the presence of a putative invasin gene homologous to ychO, not yet characterized, of E. coli str. K-12 substr. MG1655, and its effect on pathogenicity was studied. In this work, the SEPT362 strain deficient for ychO reduced the mortality rate in chicks, the adherence to chicken embryo fibroblast (CEF) cells, the invasion of chicken embryo cells (CEC-32), the survival in poultry macrophages (HD11), the motility and biofilm formation. These results suggest, for the first time, that ychO gene encodes for an invasin and plays a role in APEC SEPT362 pathogenicity. In addition to the many virulence factors, the study of different types of extracellular signals that mediate communication between bacteria and regulate gene expression opens up great possibilities to study pathogenic mechanisms and possible ways to interfere in it, transforming pathogenic organisms into non-virulent organisms. Quorum sensing (QS) is a mechanism dependent on the bacterial cell density that enables them to act as multicellular complexes, increasing their chances of survival in the environment. The QS system autoinducer 2 (AI- 2) is a universal communication system of bacteria mediated by AI- 2 produced by the action of the enzyme LuxS. The QS system autoinducer 3 (AI- 3) is a system that can also mediate communication between realms, being regulated by kinase QseC. In this context, mutants for the luxS and qseC genes were built in SEPT362 strain. The strain deficient for luxS showed a significant reduction in CEF cell adhesion due to a role in the regulation of gene type 1 fimbriae. The deficient strain for qseC had a lower rate of mortality in chicks and a significant reduction in cell adhesion to CEF, due to a lack of type 1 fimbriae in the mutant / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Conceicao_RogerioArcuri1983-_D.pdf: 4676987 bytes, checksum: 96e3babbbb52c358f5daca2c8166f056 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Estudos preliminares sobre adesão e invasão mostraram que 100% de 49 amostras de Escherichia coli associada à sepse humana (SEPEC) foram capazes de aderir e invadir células Vero (Rim de macaco verde africano) e Huvec (Veia umbilical humana). Em análise genotípica, foi observada uma alta prevalência dos genes fimH (98,0%) que codificam para a adesina da fimbria de tipo 1 (F1). No entanto, as cepas analisadas aderiram tanto na presença quanto na ausência de ?-D-manopiranosideo, um inibidor da adesão mediada pela F1. Por esse motivo foram analisadas as proteínas de membrana externa de SEPEC, com o objetivo de se avaliar potenciais fatores adesão e invasão dessas cepas. Por técnicas de proteômica, foram identificadas três proteínas de SEPEC com afinidade a glicoproteínas celulares: OmpA (Proteína de membrana A); FimA (Subunidade maior da fimbria do tipo 1) e YdeR (Subunidade menor da fimbria do tipo 9 - F9). Esses dados foram coerentes com a análise genotípica das amostras SEPEC, pois foi observada uma alta porcentagem dos genes que codificam para as três proteínas descritas anteriormente, sendo que 100% das amostras foram ompA+, 98,0% foram fimA+ e 100% foram ydeR+. Os ensaios de adesão e invasão de SEPEC (OmpA+/ F1+) em células Vero e Huvec mostraram que ?-D-manopiranosideo e GlcNAc, quando atuando juntos, agem como potentes inibidores da adesão e invasão, sugerindo que essas moléculas poderiam estar ocupando os sítios de ligação a carboidratos das duas adesinas F1 e/ou OmpA, respectivamente. Para confirmar essa hipótese, mutantes nulos para ?fimA (OmpA+/ F1-) e ?ompA (OmpA-/F1+) foram construídos, e os resultados de adesão e invasão bacteriana foram similares aos obtidos na presença dos inibidores: ?-D-manopiranosideo e GlcNAc. Mutante nulo para a proteína YdeR da fimbria F9 (OmpA+/ F1+), mostrou significativa redução da adesão e invasão bacteriana em células Vero e Huvec (p ? 0,05) somente na presença dos inibidores da adesão mediada por F1 e OmpA: ?-D-manopiranosideo e GlcNAc, respectivamente. Esses dados sugerem que F9 também contribui para a adesão e invasão de SEPEC. Juntos, nossos dados demonstram que os processos de adesão e invasão de SEPEC são dependentes de OmpA, F1 e F9, as quais podem ser complementares, e devem atuar sinergicamente para a adesão e invasão de SEPEC / Abstract: Our preliminary studies about bacterial adhesion and invasion showed 100% of 49 strains of human sepsis-associated Escherichia coli (SEPEC) were able to adhere and invade Vero (African green monkey kidney) and HUVEC (human umbilical vein) cells. In genotypic analysis, high prevalence of fimH (98.0%), gene encoding for the type 1 fimbrial adhesin was observed. However, all the strains analyzed were able to adhere and invade these cellular lineages both in the presence and absence of the type 1 fimbriae adherence-inhibitor ?-D-mannopiranoside. Consequently, the outer membrane proteins of SEPEC were analyzed in order to find potential adhesion and invasion factors expressed by these strains. Through proteomic techniques, three proteins with affinity to cellular glycoproteins were identified: OmpA (Membrane Protein A); FimA (major subunit of type 1 fimbriae - F1) and YdeR (minor subunit of type 9 fimbriae - F9). These data were consistent with the genotypic analysis of SEPEC strains because a high percentage of the genes encoding these three proteins was observed, being that ompA+ (100%) fimA+ (98%) and ydeR+ (100%). Assays of adhesion and invasion of SEPEC (OmpA+ / F1+) in Vero and HUVEC cells showed that ?-D-manopiranosideo and GlcNAc, when acting together, act as potent inhibitors of adhesion and invasion, suggesting that these molecules could be occupying sites of carbohydrate-binding displayed by adhesins from both F1 and/or OmpA, respectively. To confirm this hypothesis, null mutants ?fimA (OmpA+/F1-) and ?ompA (OmpA-/F1+) were constructed, and the phenotypic results of bacterial adhesion and invasion were similar to those obtained in the presence of inhibitors ?-D-mannopiranoside and GlcNAc. The mutant ?ydeR (OmpA+ / F1+), null mutant for YdeR protein of F9 fimbriae, showed a significant reduction in bacterial adhesion and invasion in Vero and HUVEC (p ? 0.05) just in the presence of inhibitors of cell adhesion mediated by F1 and OmpA. These data suggest that F9 also can contribute to the adhesion and invasion of SEPEC in Vero and HUVEC cells. Hold together, our data demonstrated that adhesion and invasion of SEPEC are OmpA, F1 and F9 dependents, which can be complementary and express synergistic activity leading to enhancing the ability of adhesion and invasion in SEPEC strains / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Rodrigo Tavanelli Hernandes / Resumo: A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um importante agente causador de diarreia aguda e persistente em crianças e adultos em todo o mundo. EAEC é definida como isolados de E. coli que produzem o padrão de aderência agregativa (AA) em células epiteliais (HeLa e/ou HEp-2) cultivadas in vitro. O patotipo EAEC pode ser dividido em típico e atípico com base na presença do gene aggR, que codifica um ativador transcricional, presente apenas no primeiro grupo. O objetivo deste estudo foi caracterizar uma coleção de isolados de EAEC obtidos de pacientes com diarreia durante um período de 7 anos de vigilância epidemiológica (2010-2016). Um total de 220 isolados de EAEC (194 típicas e 26 atípicas) foi classificado nos distintos grupos filogenéticos de E. coli, e caracterizados quanto aos sorotipos (O:H), padrão de aderência produzidos em células HeLa, sensibilidade aos antimicrobianos, e a presença de 25 genes responsáveis por codificarem fatores de virulência no patotipo EAEC. A maioria dos isolados de EAEC foi classificada nos grupos filogenéticos A (44,1%; 97/220) e B1 (21,4%; 47/220). Em relação ao padrão de aderência, observamos que 92,7% (204/220) produziram o padrão AA. Além disso, foram identificados nove isolados (4,1%; 9/220) que produziram a aderência em cadeia (CLA), dos quais seis produziram concomitantemente o padrão AA, além de isolados de EAEC que produzem um padrão de aderência indefinido (1,4%; 3/220) e isolados não aderentes (3,6%; 8/220). Foi identificado some... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an important agent that causes acute and persistent diarrhea in children and adults worldwide. EAEC is defined as E. coli isolates that produce the aggregative adherence pattern (AA) on epithelial cells (HeLa and/or HEp-2) cultured in vitro. The EAEC pathotype can be divided in typical and atypical based on the presence of the aggR gene, which encodes a transcriptional activator, in the former group. The aim of this study was to characterize a collection of EAEC isolates obtained from diarrheal patients over a 7-year period of surveillance (2010-2016). A total of 220 EAEC isolates (194 typical and 26 atypical) were evaluated regarding the phylogenetic classification, serotypes, adherence pattern produced on HeLa cells, susceptibility to antimicrobial drugs and the presence of 25 virulence factor-encoding genes. The majority of the EAEC isolates were assigned to phylogroups A (44.1%; 97/220) and B1 (21.4%; 47/220). Regarding the adherence pattern, was observed that 92.7% (204/220) produced AA. Moreover, we identified nine isolates (4.1%; 9/220) that produced the chain-like adherence (CLA), with six of them producing concomitantly the AA pattern, besides EAEC isolates producing an undefined adherence (1.4%; 3/220) and isolates non-adherent (3.6%; 8/220). Only 0.9% (2/220) of the EAEC isolates studied presented the multidrug resistance phenotype. The genes encoding for the major pilin subunit of all five previously described aggregati... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 &#181;L do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 &#181;l of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 &#181;L do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 &#181;l of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.