O tabagismo durante a gravidez é o principal fator de risco previsível associado com complicações tanto no parto quanto na gestação. Estão relacionados, por exemplo, partos prematuros, baixo peso ao nascer, doenças no trato respiratório do feto e, com a morte infantil. A exposição à fumaça do tabaco pode ser avaliada através da presença de nicotina e cotinina nos fluidos biológicos, incluindo plasma, soro, urina, saliva, cabelo e unha. A saliva é uma matriz alternativa que apresenta como vantagens a facilidade de obtenção, não é uma amostra invasiva, a coleta pode ser assistida, é de baixo custo, o risco de contração de infecções durante a coleta e manuseio da amostra é mínimo e pode ser utilizada em situações que é difícil a obtenção de outro tipo de amostra. Como a prevalência de gestantes fumantes de cigarro é relativamente alta, é importante uma confirmação por um laboratório de análise para classificar de forma correta e confiável se a gestante é fumante ou não. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver e validar um método para análise de nicotina e cotinina em amostras de saliva de gestantes. Foi utilizada a extração líquido-líquido para o preparo das amostras de saliva e foi realizada a cromatografia em fase gasosa com detector termiônico específico para a separação, identificação e quantificação dos analitos nicotina, cotinina e do padrão interno ketamina. O limite de detecção foi de 10 ng/mL para nicotina e de 6 ng/mL para cotinina. Os limites inferiores de quantificação foram de 40 ng/mL e 20 ng/mL para a nicotina e cotinina, respectivamente. O método foi considerado linear na faixa de concentração de 40 a 2000 ng/mL (R=0,996) para a nicotina e de 20 a 2000 ng/mL (R=0,999) para a cotinina. Os valores de recuperação dos analitos variaram de 66,1% a 92,2%. A precisão intradia apresentou uma variação de 6,06% a 11,50% e a precisão interdia variou de 6,89% a 10,57%. A exatidão intradia variou de -11,29% a 19,81%, e os valores da exatidão interdia variaram de -11,78% a 13,08%. Ambos os analitos apresentaram estabilidade nas amostras biológicas e em solução. Na primeira avaliação (período gestacional de 1 a 25 semanas), o método foi aplicado em 259 amostras de saliva de gestantes fumantes e não fumantes. E na segunda (período gestacional de 36 a 40 semanas e até 113 dias após o parto), foi aplicado em 45 amostras de gestantes fumantes. Foi observada uma diferença significativa ao comparar o autorrelato das gestantes fumantes e não fumantes, na primeira avaliação, com a concentração de nicotina e cotinina nas amostras de saliva (p<0,001). As concentrações de cotinina em amostras de saliva correlacionaram positivamente com o número de cigarros consumidos diariamente pelas gestantes fumantes, na primeira avaliação (p<0,001). Não foram obtidas diferenças estaticamente significativas para as variáveis: número de cigarros diários (p=0,255), concentração de nicotina (p=0,949) e cotinina (p=0,665). O ponto de corte da nicotina foi maior que zero, com sensibilidade de 36,8% e especificidade de 97,7%. Para a cotinina, o ponto de corte foi maior que 17,2 ng/mL, com sensibilidade de 94,3% e especificidade de 98,8%. O método analítico desenvolvido e validado atendeu aos critérios exigidos pela resolução 27/2012 e à 899/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. / Smoking during pregnancy is the main factor associated with complications in both and gestation. It is related, for example, premature births, low birth weight, diseases in the respiratory tract of the fetus and, with child death. Exposure to tobacco smoke can be assessed by the presence of nicotine and cotinine in biological fluids including plasma, serum, urine, saliva, hair and nails. The saliva is an alternative matrix that presents as advantages the ease of obtaining, is not an invasive sample, the collection can be assisted, it is of low cost, the risk of contraction of infections during the collection and handling of the sample is minimal and can be used in situations where it is difficult to obtain another type of sample. As the prevalence of pregnant cigarette smokers is relatively high, confirmation by an analysis laboratory is important to correctly and reliably classify whether the pregnant woman is a smoker or not. The objective of this research was to develop and validate a method for the analysis of nicotine and cotinine in saliva samples from pregnant women. Liquid-liquid extraction was used for the preparation of saliva samples and gas chromatography with specific thermionic detector was performed for the separation, identification and quantification of the analytes nicotine, cotinine and the internal standard ketamine. The limit of detection was 10 ng/mL for nicotine and 6 ng/mL for cotinine. The lower limits of quantification were 40 ng/mL and 20 ng/mL for nicotine and cotinine, respectively. The method was considered linear in the concentration range of 40 to 2000 ng/mL (R=0.996) for nicotine and 20-2000 ng/mL (R=0.999) for cotinine. The recovery values of the analytes range from 66.1% to 92.2%. The intraday precision ranged from 6.06% to 11.50% and the interday precision ranged from 6.89% to 10.57%. The intraday accuracy ranged from -11.29% to 19.81%, and the interday accuracy ranged from -11.78% to 13.08%. Both analytes presented stability in the biological samples and in solution. At the first evaluation (gestational period of 1 to 25 weeks), the method was applied to 259 saliva samples from pregnant smokers and nonsmokers. And in the second (gestational period of 36 to 40 weeks and up to 113 days postpartum), it was applied in 45 samples of pregnant smokers. A significant difference was observed when comparing the self-report of pregnant smokers and nonsmokers in the first evaluation with the concentration of nicotine and cotinine in saliva samples (p<0.001). The concentrations of cotinine in saliva samples correlated positively with the number of cigarettes consumed daily by pregnant smokers in the first evaluation (p<0.001). No statistically significant differences were found for the variables: number of daily cigarettes (p=0.255), nicotine concentration (p=0.949) and cotinine (p=0.665). The cutoff point of nicotine was greater than zero, with sensitivity of 36.8% and specificity of 97.7%. For cotinine, the cutoff point was greater than 17.2 ng/mL, with sensitivity of 94.3% and specificity of 98.8%. The analytical method developed and validated met the criteria required by resolution 27/2012 and 899/2003 of the National Sanitary Surveillance Agency.

O mecônio é uma matéria fecal que começa a acumular no intestino do feto por volta do terceiro mês de gestação e normalmente é eliminado nos primeiros dias de vida do recém nascido. No mecônio ocorre o acúmulo de substâncias com as quais a mãe entrou em contato durante o período de gestação e, portanto, sendo possível avaliar a exposição fetal. Nos casos de mães fumantes, compostos presentes no tabaco tais como nicotina e substâncias que são formadas após a metabolização da nicotina como por exemplo a cotinina, podem ser também detectadas nas amostras de mecônio, já que ocorre o acúmulo de nicotina e seus metabólitos no mesmo. O uso do cigarro durante o período gestacional acarreta em uma série de problemas ao feto como baixo peso ao nascer, parto pré-maturo, doenças no trato respiratório, dentre outros. Nos dias atuais é possível fazer a pesquisa de drogas lícitas e ilícitas em várias amostras biológicas tais como, sangue, urina, cabelo, fluido oral, mecônio, entre outras. O mecônio é uma boa opção, por vários motivos: amostragem fácil e não invasiva (a coleta pode ser feita na fralda), indica o histórico do uso de substâncias pela mãe durante a gestação por ser cumulativo, etc. O objetivo foi desenvolver e validar um método analítico empregando cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas para a determinação de nicotina e, seu metabólito, cotinina em amostras de mecônio coletadas de recém nascidos. Para o desenvolvimento do método foi utilizado 0,5g de mecônio e os analitos foram extraídos com metanol e em seguida a amostra foi submetida a purificação através da extração em fase sólida utilizando cartuchos Bond Elut Certify I. O método foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pela ANVISA e demonstrou linearidade de 160 1600 ng/g para nicotina e de 160 1000 ng/g para cotinina. Os limites de detecção estabelecidos foram de 10 ng/g para nicotina e 60 ng/g para cotinina, enquanto os limites de quantificação foram de 60 ng/g para nicotina e 100 ng/g para cotinina. A exatidão apresentou valores de 91,73% a 103,73%, a precisão intra-ensaio variou entre 3,21% a 10,86%, e a precisão inter-ensaio obteve valores entre 4,91% a 9,88%. O método validado foi aplicado em amostras de mecônio coletadas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP). / Meconium is a fecal matter passed by the newborn after birth. It begins to form around the 3th month of gestation and accumulates in the fetus until birth. Substances which the mothers had contact during the gestation period may accumulate in meconium and, therefore, its possible to assess fetal exposure. Substances from the tobacco smoke, like nicotine and its metabolite cotinine, also accumulates in the meconium and can be detected .Maternal smoking during pregnancy is hazardous to the fetus and it is associated with low birth weight, prematurity, respiratory tract infections and others. Nowadays it is possible to assess licit and illicit drugs in several biological samples like blood, urine, hair, oral fluid, meconium and others. Meconium is the best choice because its easy to collect and its noninvasive, indicates a history of substances use by the mother in the latter half of pregnancy, etc. The purpose of this study was to develop and validate a methodology using gas chromatography-mass spectrometry to assess nicotine and cotinine in meconium samples collected from newborns. To the development of the methodology 0,5g of meconium was used per assay and the analytes were extracted from the matrix using methanol. Then, a solid phase extraction was applied using Bond Elut Certify I cartridges. The methodology was validated in the range of 160 1600 ng/g for nicotine and 160 - 1000 ng/g for cotinine. The limit of detection established was 10 ng/g for nicotine and 60 ng/g for cotinine, while the limit of quantification was 60 ng/g for nicotine and 100 ng/g for cotinine. The accuracy showed values between 91,73% and 103,73%, the intra-assay precision between 3,21% and 10,86% and the inter-assay precision between 4,91% and 9,88%. The validated methodology was applied to analysis of meconium samples collected from newborns in the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP).

O presente trabalho teve como objetivo sintetizar, caracterizar e avaliar o desempenho de um polímero de impressão molecular magnético (MMIP – magnetic molecularly imprinted polymers) na extração seletiva de nicotina e cotinina em amostras de urina, com posterior análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Para tal, nanopartículas de Fe3O4 foram preparadas pelo método de co-precipitação com posterior modificação da sua superfície por silanização, que envolve a estabilização com tetraetilortosilicato (TEOS) seguida da funcionalização com 3-​(Trimethoxysilyl)​propyl methacrylate (MPS). O MIP foi sintetizado sobre as nanopartículas magnéticas pelo método de polimerização por precipitação, empregando-se nicotina, ácido metacrílico, etileno glicol dimetacrilato, ácido 4,4’-azobis(4-cianovalérico), e acetonitrila como molécula modelo, monômero funcional, agente de ligação cruzada, iniciador radicalar e solvente de síntese, respectivamente. As partículas sintetizadas foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV, Microscopia de Força Atômica – AFM, Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier - FT-IR, Espectrometria de Energia Dispersiva de Raios-X - EDS e Análise Termogravimétrica – TGA. O MMIP foi empregado na extração em fase sólida dispersiva de nicotina e cotinina em urina, empregando-se um imã externo para separar as partículas da amostra. O extrato foi analisado por GC-MS, operado no modo SIM e as relações m/z monitoradas foram 84, 133 e 162 para a nicotina e 98, 147 e 176 para a cotinina. A faixa analítica foi de 0,1 a 3,0 mg L-1 (r >0,99), com limite de quantificação (LQ) de 0,1 mg L-1 para ambos analitos. As precisões intra e interdia (na forma de desvio padrão relativo) foram menores que 20 % para o LQ e menores que 15% para os demais pontos; e as exatidões intra e inter dia (na forma de erro relativo) ficaram compreendidas entre ± 9%. O método foi empregado na análise de nicotina e cotinina em quatro amostras de urina de fumantes. Os valores obtidos para cotinina encontram-se na faixa de 0,19 a 0,28 mg L-1, enquanto que a nicotina foi detectada em concentrações menores que o LQ. Assim, o método mostrou-se adequado para monitorização da exposição ao tabaco, já que a cotinina é o bioindicador mais indicado para esta finalidade. / In this study, a magnetic molecularly imprinted polymer (MMIP) was synthesized, characterized and used in the selective extraction of nicotine and cotinine from urine samples followed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis. Fe3O4 nanoparticles were prepared by the co-precipitation method using FeCl3.6H2O, FeCl2.4H2O and ammonia. After, the particles were silanized/stabilized with tetraethyl orthosilicate (TEOS), and functionalized with 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate (MPS). The MIP has been prepared on the magnetic nanoparticles by the precipitation polymerization method, using nicotine, methacrylic acid, ethylene glycol dimethacrylate, 4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) and acetonitrile as template, functional monomer, cross-linker, initiator and solvent, respectively. The materials were characterized by scanning electron microscopy, atomic force microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, energy dispersive X-ray spectrometry and thermogravimetry. All the characterization results confirmed the nature of the Fe3O4 nanoparticles, as well as their subsequent treatments with TEOS, MPS and the MIP synthesis. The particles were used to extract nicotine and cotinine from urine samples in a dispersive solid phase extraction procedure employing an external magnet to separate the particles from the sample. The extracts were analyzed by GC-MS. Selective ion monitoring (SIM) mode was used and three ions in a group at m/z 162, 84, 133, and m/z 176, 147, 98 were used to monitor nicotine and cotinine, respectively. The analytical range was 0.1 to 3.0 mg L-1 (r > 0.99), with a limit of quantitation (LOQ) of 0.1 mg L-1 for both analytes. The intra- and interday precision (as RSD) were less than 20% for the LOQ and less than 15% for other points; and intra- and inter day accuracies (as relative error) were within ± 9%. The method was employed to analyze nicotine and cotinine in four smokers' urine samples. The cotinine concentrations ranged from 0.19 to 0.28 mg L-1, whereas the nicotine was detected in concentrations lower than LOQ. Thus, the method was suitable for tobacco exposure monitoring, once the cotinine can be considered the most suitable biomarker for this purpose. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Introdução: Muitos estudos relacionam o tabagismo materno durante a gestação com o aumento do risco de desfechos adversos para o feto, como o baixo peso ao nascer e restrição de crescimento intrauterino. Os objetivos deste trabalho foram: estabelecer um modelo animal de exposição ao tabaco durante a prenhez, usando como marcador de exposição a cotinina e a carboxihemoglobina; investigar os efeitos da exposição pré-natal ao tabaco sobre a biometria fetal e parâmetros bioquímicos; e investigar a programação fetal e suas repercussões na vida adulta. Métodos: Ratas Wistar foram randomicamente divididas em 3 grupos de exposição ao tabaco durante a gestação: controle (C), controle manipulado (CM) e tabaco (T). No grupo T as ratas foram expostas a fumaça de um cigarro 2x/dia, durante 21 dias. O grupo CM passou pela mesma intervenção do grupo T, porém sem sofrer exposição à fumaça do cigarro. O grupo C permaneceu na caixa-moradia sem qualquer tipo de interferência. O protocolo do presente estudo foi dividido em 2 experimentos. Experimento 1: no 22º dia de gestação um grupo de ratas genitoras foi submetida à cirurgia cesariana para a retirada dos filhotes. O sangue do tronco das genitoras foi coletado e o peso da placenta, bem como o comprimento e o peso dos filhotes foram medidos. Experimento 2: no 22º dia de gestação, um outro grupo de genitoras tiveram seus filhotes nascidos de parto normal e as ninhadas foram padronizadas em 8 filhotes. O peso dos filhotes foi aferido semanalmente até a vida adulta, quando foram realizados o teste de tolerância à glicose, o teste de corticosterona em resposta ao estresse e a medida da gordura abdominal. Para a medida da carboxihemoglobina (COHb) nas genitoras o sangue foi coletado imediatamente após a exposição a fumaça do cigarro. Resultados: O grupo exposto ao tabaco de forma aguda apresentou níveis mais elevados de COHb que o grupo CM. A exposição repetida ao tabaco aumentou substancialmente os níveis de cotinina, enquanto os grupos CM e C apresentaram níveis de cotinina abaixo do limite de detecção do método. Foi observado que os filhotes expostos ao tabaco no período intrauterino nasceram com menor peso e menores níveis de insulina e glicemia. Em relação ao experimento 2, o acompanhamento do ganho de peso até a vida adulta não diferiu entre os grupos, somente entre os sexos, assim como a adiposidade. O teste de tolerância à glicose na vida adulta mostrou que o grupo exposto ao tabaco durante o período intrauterino apresentou resistência à ação da insulina. Conclusão: O modelo animal utilizado para expor ao tabaco durante a prenhez foi capaz de induzir a restrição do crescimento intrauterino (RCIU) e de programar o metabolismo na vida adulta. Este modelo animal mostra-se útil na investigação de outros desfechos e mecanismos relacionados à exposição tabágica durante a gestação. / Introduction: Many studies have linked maternal smoking during pregnancy with increased risk of adverse outcomes. The objective of this study was to establish an animal model of tobacco exposure during pregnancy, using as a marker of exposure to cotinine and carboxyhemoglobin. Also, investigate the effects of prenatal exposure to tobacco smoke on fetal biometry and biochemical parameters. It also aimed to investigate the fetal programming and its repercussions in adulthood. Methodology: Repeated exposure to tobacco smoke during pregnancy: The animals were randomly assigned to three groups: control (C), manipulated control (MC) and tobacco (T). The animals were exposed to a one cigarette twice a day for 21 days. The manipulated control group went through the same intervention group T, without suffering smoke exposure. The group C remained intact in the home cage. Experiment 1: on 22nd day of pregnancy was performed a cesarean section. The trunk blood was collected of the pregnant rats and fetal biometry measured. Experiment 2: on the 22nd day of pregnancy the pups were born by natural delivery and the litters were standardized to eight pups per litter. The weight of offspring was measured weekly until adulthood. At this stage we evaluated the glucose tolerance test and, at the time of sacrifice, the adiposity. Immediately after the intervention, the trunk blood was collected for carboxyhemoglobin (COHb) measurement. Results: the animals exposed to tobacco acutely showed higher levels of COHb that the MC group. Repeated exposure to tobacco increased substantially cotinine levels, whereas in MC and C groups cotinine levels were below the limit of detection. It was observed that pups exposed to tobacco intrauterine period were born with lower weight and lower levels of insulin and glucose. Regarding the second experiment, monitoring of weight gain until adulthood did not differ between groups, only gender, and adiposity. The glucose tolerance test in adult life showed that the group exposed to tobacco during the intrauterine period showed resistance to insulin action. Conclusion: The animal model used to expose the tobacco during pregnancy was able to induce intrauterine growth restriction and programming metabolism in later life. This animal model shown to be useful for studies on other outcomes, and mechanisms related to tobacco smoke exposure during pregnancy.

Introdução: Muitos estudos relacionam o tabagismo materno durante a gestação com o aumento do risco de desfechos adversos para o feto, como o baixo peso ao nascer e restrição de crescimento intrauterino. Os objetivos deste trabalho foram: estabelecer um modelo animal de exposição ao tabaco durante a prenhez, usando como marcador de exposição a cotinina e a carboxihemoglobina; investigar os efeitos da exposição pré-natal ao tabaco sobre a biometria fetal e parâmetros bioquímicos; e investigar a programação fetal e suas repercussões na vida adulta. Métodos: Ratas Wistar foram randomicamente divididas em 3 grupos de exposição ao tabaco durante a gestação: controle (C), controle manipulado (CM) e tabaco (T). No grupo T as ratas foram expostas a fumaça de um cigarro 2x/dia, durante 21 dias. O grupo CM passou pela mesma intervenção do grupo T, porém sem sofrer exposição à fumaça do cigarro. O grupo C permaneceu na caixa-moradia sem qualquer tipo de interferência. O protocolo do presente estudo foi dividido em 2 experimentos. Experimento 1: no 22º dia de gestação um grupo de ratas genitoras foi submetida à cirurgia cesariana para a retirada dos filhotes. O sangue do tronco das genitoras foi coletado e o peso da placenta, bem como o comprimento e o peso dos filhotes foram medidos. Experimento 2: no 22º dia de gestação, um outro grupo de genitoras tiveram seus filhotes nascidos de parto normal e as ninhadas foram padronizadas em 8 filhotes. O peso dos filhotes foi aferido semanalmente até a vida adulta, quando foram realizados o teste de tolerância à glicose, o teste de corticosterona em resposta ao estresse e a medida da gordura abdominal. Para a medida da carboxihemoglobina (COHb) nas genitoras o sangue foi coletado imediatamente após a exposição a fumaça do cigarro. Resultados: O grupo exposto ao tabaco de forma aguda apresentou níveis mais elevados de COHb que o grupo CM. A exposição repetida ao tabaco aumentou substancialmente os níveis de cotinina, enquanto os grupos CM e C apresentaram níveis de cotinina abaixo do limite de detecção do método. Foi observado que os filhotes expostos ao tabaco no período intrauterino nasceram com menor peso e menores níveis de insulina e glicemia. Em relação ao experimento 2, o acompanhamento do ganho de peso até a vida adulta não diferiu entre os grupos, somente entre os sexos, assim como a adiposidade. O teste de tolerância à glicose na vida adulta mostrou que o grupo exposto ao tabaco durante o período intrauterino apresentou resistência à ação da insulina. Conclusão: O modelo animal utilizado para expor ao tabaco durante a prenhez foi capaz de induzir a restrição do crescimento intrauterino (RCIU) e de programar o metabolismo na vida adulta. Este modelo animal mostra-se útil na investigação de outros desfechos e mecanismos relacionados à exposição tabágica durante a gestação. / Introduction: Many studies have linked maternal smoking during pregnancy with increased risk of adverse outcomes. The objective of this study was to establish an animal model of tobacco exposure during pregnancy, using as a marker of exposure to cotinine and carboxyhemoglobin. Also, investigate the effects of prenatal exposure to tobacco smoke on fetal biometry and biochemical parameters. It also aimed to investigate the fetal programming and its repercussions in adulthood. Methodology: Repeated exposure to tobacco smoke during pregnancy: The animals were randomly assigned to three groups: control (C), manipulated control (MC) and tobacco (T). The animals were exposed to a one cigarette twice a day for 21 days. The manipulated control group went through the same intervention group T, without suffering smoke exposure. The group C remained intact in the home cage. Experiment 1: on 22nd day of pregnancy was performed a cesarean section. The trunk blood was collected of the pregnant rats and fetal biometry measured. Experiment 2: on the 22nd day of pregnancy the pups were born by natural delivery and the litters were standardized to eight pups per litter. The weight of offspring was measured weekly until adulthood. At this stage we evaluated the glucose tolerance test and, at the time of sacrifice, the adiposity. Immediately after the intervention, the trunk blood was collected for carboxyhemoglobin (COHb) measurement. Results: the animals exposed to tobacco acutely showed higher levels of COHb that the MC group. Repeated exposure to tobacco increased substantially cotinine levels, whereas in MC and C groups cotinine levels were below the limit of detection. It was observed that pups exposed to tobacco intrauterine period were born with lower weight and lower levels of insulin and glucose. Regarding the second experiment, monitoring of weight gain until adulthood did not differ between groups, only gender, and adiposity. The glucose tolerance test in adult life showed that the group exposed to tobacco during the intrauterine period showed resistance to insulin action. Conclusion: The animal model used to expose the tobacco during pregnancy was able to induce intrauterine growth restriction and programming metabolism in later life. This animal model shown to be useful for studies on other outcomes, and mechanisms related to tobacco smoke exposure during pregnancy.

Introdução: Muitos estudos relacionam o tabagismo materno durante a gestação com o aumento do risco de desfechos adversos para o feto, como o baixo peso ao nascer e restrição de crescimento intrauterino. Os objetivos deste trabalho foram: estabelecer um modelo animal de exposição ao tabaco durante a prenhez, usando como marcador de exposição a cotinina e a carboxihemoglobina; investigar os efeitos da exposição pré-natal ao tabaco sobre a biometria fetal e parâmetros bioquímicos; e investigar a programação fetal e suas repercussões na vida adulta. Métodos: Ratas Wistar foram randomicamente divididas em 3 grupos de exposição ao tabaco durante a gestação: controle (C), controle manipulado (CM) e tabaco (T). No grupo T as ratas foram expostas a fumaça de um cigarro 2x/dia, durante 21 dias. O grupo CM passou pela mesma intervenção do grupo T, porém sem sofrer exposição à fumaça do cigarro. O grupo C permaneceu na caixa-moradia sem qualquer tipo de interferência. O protocolo do presente estudo foi dividido em 2 experimentos. Experimento 1: no 22º dia de gestação um grupo de ratas genitoras foi submetida à cirurgia cesariana para a retirada dos filhotes. O sangue do tronco das genitoras foi coletado e o peso da placenta, bem como o comprimento e o peso dos filhotes foram medidos. Experimento 2: no 22º dia de gestação, um outro grupo de genitoras tiveram seus filhotes nascidos de parto normal e as ninhadas foram padronizadas em 8 filhotes. O peso dos filhotes foi aferido semanalmente até a vida adulta, quando foram realizados o teste de tolerância à glicose, o teste de corticosterona em resposta ao estresse e a medida da gordura abdominal. Para a medida da carboxihemoglobina (COHb) nas genitoras o sangue foi coletado imediatamente após a exposição a fumaça do cigarro. Resultados: O grupo exposto ao tabaco de forma aguda apresentou níveis mais elevados de COHb que o grupo CM. A exposição repetida ao tabaco aumentou substancialmente os níveis de cotinina, enquanto os grupos CM e C apresentaram níveis de cotinina abaixo do limite de detecção do método. Foi observado que os filhotes expostos ao tabaco no período intrauterino nasceram com menor peso e menores níveis de insulina e glicemia. Em relação ao experimento 2, o acompanhamento do ganho de peso até a vida adulta não diferiu entre os grupos, somente entre os sexos, assim como a adiposidade. O teste de tolerância à glicose na vida adulta mostrou que o grupo exposto ao tabaco durante o período intrauterino apresentou resistência à ação da insulina. Conclusão: O modelo animal utilizado para expor ao tabaco durante a prenhez foi capaz de induzir a restrição do crescimento intrauterino (RCIU) e de programar o metabolismo na vida adulta. Este modelo animal mostra-se útil na investigação de outros desfechos e mecanismos relacionados à exposição tabágica durante a gestação. / Introduction: Many studies have linked maternal smoking during pregnancy with increased risk of adverse outcomes. The objective of this study was to establish an animal model of tobacco exposure during pregnancy, using as a marker of exposure to cotinine and carboxyhemoglobin. Also, investigate the effects of prenatal exposure to tobacco smoke on fetal biometry and biochemical parameters. It also aimed to investigate the fetal programming and its repercussions in adulthood. Methodology: Repeated exposure to tobacco smoke during pregnancy: The animals were randomly assigned to three groups: control (C), manipulated control (MC) and tobacco (T). The animals were exposed to a one cigarette twice a day for 21 days. The manipulated control group went through the same intervention group T, without suffering smoke exposure. The group C remained intact in the home cage. Experiment 1: on 22nd day of pregnancy was performed a cesarean section. The trunk blood was collected of the pregnant rats and fetal biometry measured. Experiment 2: on the 22nd day of pregnancy the pups were born by natural delivery and the litters were standardized to eight pups per litter. The weight of offspring was measured weekly until adulthood. At this stage we evaluated the glucose tolerance test and, at the time of sacrifice, the adiposity. Immediately after the intervention, the trunk blood was collected for carboxyhemoglobin (COHb) measurement. Results: the animals exposed to tobacco acutely showed higher levels of COHb that the MC group. Repeated exposure to tobacco increased substantially cotinine levels, whereas in MC and C groups cotinine levels were below the limit of detection. It was observed that pups exposed to tobacco intrauterine period were born with lower weight and lower levels of insulin and glucose. Regarding the second experiment, monitoring of weight gain until adulthood did not differ between groups, only gender, and adiposity. The glucose tolerance test in adult life showed that the group exposed to tobacco during the intrauterine period showed resistance to insulin action. Conclusion: The animal model used to expose the tobacco during pregnancy was able to induce intrauterine growth restriction and programming metabolism in later life. This animal model shown to be useful for studies on other outcomes, and mechanisms related to tobacco smoke exposure during pregnancy.

O mecônio é uma matéria fecal que começa a acumular no intestino do feto por volta do terceiro mês de gestação e normalmente é eliminado nos primeiros dias de vida do recém nascido. No mecônio ocorre o acúmulo de substâncias com as quais a mãe entrou em contato durante o período de gestação e, portanto, sendo possível avaliar a exposição fetal. Nos casos de mães fumantes, compostos presentes no tabaco tais como nicotina e substâncias que são formadas após a metabolização da nicotina como por exemplo a cotinina, podem ser também detectadas nas amostras de mecônio, já que ocorre o acúmulo de nicotina e seus metabólitos no mesmo. O uso do cigarro durante o período gestacional acarreta em uma série de problemas ao feto como baixo peso ao nascer, parto pré-maturo, doenças no trato respiratório, dentre outros. Nos dias atuais é possível fazer a pesquisa de drogas lícitas e ilícitas em várias amostras biológicas tais como, sangue, urina, cabelo, fluido oral, mecônio, entre outras. O mecônio é uma boa opção, por vários motivos: amostragem fácil e não invasiva (a coleta pode ser feita na fralda), indica o histórico do uso de substâncias pela mãe durante a gestação por ser cumulativo, etc. O objetivo foi desenvolver e validar um método analítico empregando cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas para a determinação de nicotina e, seu metabólito, cotinina em amostras de mecônio coletadas de recém nascidos. Para o desenvolvimento do método foi utilizado 0,5g de mecônio e os analitos foram extraídos com metanol e em seguida a amostra foi submetida a purificação através da extração em fase sólida utilizando cartuchos Bond Elut Certify I. O método foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pela ANVISA e demonstrou linearidade de 160 1600 ng/g para nicotina e de 160 1000 ng/g para cotinina. Os limites de detecção estabelecidos foram de 10 ng/g para nicotina e 60 ng/g para cotinina, enquanto os limites de quantificação foram de 60 ng/g para nicotina e 100 ng/g para cotinina. A exatidão apresentou valores de 91,73% a 103,73%, a precisão intra-ensaio variou entre 3,21% a 10,86%, e a precisão inter-ensaio obteve valores entre 4,91% a 9,88%. O método validado foi aplicado em amostras de mecônio coletadas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP). / Meconium is a fecal matter passed by the newborn after birth. It begins to form around the 3th month of gestation and accumulates in the fetus until birth. Substances which the mothers had contact during the gestation period may accumulate in meconium and, therefore, its possible to assess fetal exposure. Substances from the tobacco smoke, like nicotine and its metabolite cotinine, also accumulates in the meconium and can be detected .Maternal smoking during pregnancy is hazardous to the fetus and it is associated with low birth weight, prematurity, respiratory tract infections and others. Nowadays it is possible to assess licit and illicit drugs in several biological samples like blood, urine, hair, oral fluid, meconium and others. Meconium is the best choice because its easy to collect and its noninvasive, indicates a history of substances use by the mother in the latter half of pregnancy, etc. The purpose of this study was to develop and validate a methodology using gas chromatography-mass spectrometry to assess nicotine and cotinine in meconium samples collected from newborns. To the development of the methodology 0,5g of meconium was used per assay and the analytes were extracted from the matrix using methanol. Then, a solid phase extraction was applied using Bond Elut Certify I cartridges. The methodology was validated in the range of 160 1600 ng/g for nicotine and 160 - 1000 ng/g for cotinine. The limit of detection established was 10 ng/g for nicotine and 60 ng/g for cotinine, while the limit of quantification was 60 ng/g for nicotine and 100 ng/g for cotinine. The accuracy showed values between 91,73% and 103,73%, the intra-assay precision between 3,21% and 10,86% and the inter-assay precision between 4,91% and 9,88%. The validated methodology was applied to analysis of meconium samples collected from newborns in the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP).

O uso de drogas por mulheres em idade reprodutiva é considerado um grave problema de saúde pública mundial. O mecônio é a primeira excreção do recém-nascido e tem sido utilizado como uma matriz alternativa em análises toxicológicas. A extração em fase sólida (SPE) é um método amplamente utilizado para a purificação e concentração dos analitos em amostras biológicas no campo da análise forense. A maioria dos produtos de SPE convencionais requerem volumes relativamente grandes de solventes levando a um custo acrescido por amostra e um aumento no tempo de processamento da amostra. As ponteiras de extração com fase sólida modificada (DPX) foram utilizadas como uma alternativa aos cartuchos SPE tradicionais. A técnica combina eficiência e rapidez no procedimento de extração, com redução significativa no consumo de solvente e na quantidade de amostra. O objetivo desse estudo foi desenvolver e validar um método para a determinação de nicotina, cotinina, cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno e éster metil anidroecgonina em amostras de mecônio usando DPX e cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC/MS). Os resultados da validação indicaram uma extração eficiente, exata e precisa, com recuperação entre 50-98%, exatidão entre 92-106%, precisão intra-ensaio 4-12% e precisão inter-ensaio 6 a 12%. As curvas de calibração foram lineares com valores de R2 superiores a 0,99; os limites de detecção (LOD) variaram entre 2,5-15 ng/g e os limites de quantificação (LOQ) entre 10-20 ng/g. O método DPX-GC/MS mostrou ser eficaz para análise traços de drogas presentes em amostras de mecônio. Após desenvolvimento e validação, o método foi aplicado em 50 amostras de mecônio coletadas no berçário da Maternidade do Complexo Aeroporto (MATER) na cidade de Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil. / Drug abuse by pregnant women is considered a serious public health problem worldwide. Meconium is the first excretion in newborns and has been used as an alternative matrix to evaluate in utero drug exposure. Solid phase extraction (SPE) is widely employed to prepare and cleanup samples in the field of forensic analysis. Most SPE products require large volumes of solvent, which culminates in longer sample processing times; increased cost per sample and higher limits of detection. Disposable Pipette Extraction tips (DPX) have been used as an alternative to traditional SPE cartridges. They combine efficient and rapid extraction with reduced solvent consumption. The purpose of this study was to develop and validate a method to determine nicotine, cotinine, cocaine, benzoylecgonine, cocaethylene and methyl ester anhydroecgonine in meconium using DPX and GC/MS. Validation results indicated extraction efficiency, ranged between 50-98%, accuracy 92-106%, intra-assay precision 4-12% and inter-assay precision 6 to 12%. Linear calibration curves resulted in R2 values greater than 0.99; limits of detection ranged from 2.5 - 15 ng/g and the limit of quantitation from 10 - 20 ng/g. The DPX-GC/MS method provided to selectively analyze trace concentrations of drugs in meconium samples. Finally, the developed and validated method was applied to 50 meconium samples collected at the nursery of Maternidade do Complexo Aeroporto (MATER) in the city of Ribeirão Preto - São Paulo, Brazil.

Orientadores: Francisco Carlos Groppo, Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-12T19:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cogo_Karina_D.pdf: 3355648 bytes, checksum: d8afd799c6d162cda6cbb9bad9d225a5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O uso do cigarro tem sido associado com a progressão da periodontite bem como com a redução da resposta à terapia aplicada a essa doença. Porphyromonas gingivalis é um importante colonizador do biofilme subgengival além de ser um dos principais patógenos envolvidos no estabelecimento e progressão da doença periodontal. No entanto, os possíveis efeitos dos principais derivados do cigarro sobre P. gingivalis ainda não foram totalmente investigados. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da nicotina e cotinina sobre a expressão de proteínas e sobre a capacidade de adesão e invasão celular de P. gingivalis. A fim de avaliar a expressão de proteínas, culturas de P. gingivalis W83 foram expostas à nicotina e cotinina nas concentrações de 6 e 600µg/mL, as proteínas foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (12.5% SDS-PAGE) e identificadas por LC-MS/MS. Os géis e suas corridas eletroforéticas foram feitas em triplicatas e a detecção de proteínas nos mesmos foi feita através de coloração com corante Coomassie. Proteínas diferentemente expressas foram digeridas com tripsina e as amostras de peptídeos sequenciadas utilizando um sistema Q-TOF API LC-MS/MS. A busca MS/MS foi realizada utilizando os bancos de dados MSDB e NCBI através do programa Mascot. Para examinar a capacidade de adesão e invasão de P. gingivalis, monocamadas de células KB e culturas de P. gingivalis ATCC 33277 foram expostas às concentrações de 0.1, 10 e 100 µg/mL de nicotina e cotinina. As células epiteliais foram incubadas por 24 h enquanto P. gingivalis foi exposta a essas substâncias até atingir a fase logarítmica. Após o período de incubação, P. gingivalis foi submetida aos ensaios de adesão e invasão às células KB. O número de bactérias associadas às células foi obtido através de contagem de unidades formadoras de colônia. Os resultados obtidos da análise expressão de proteínas mostraram que a adição de nicotina e cotinina promoveram alterações no proteoma de P. gingivalis. Entre os ± 430 spots de proteínas reproduzíveis detectados em cada gel, 20 proteínas foram menos expressas e 42 foram mais expressas em pelo menos um dos tratamentos (p<0.05; ANOVA - Tukey). Entre as proteínas identificadas, muitas estavam envolvidas em processos como produção de energia celular, síntese de proteínas, estresse oxidativo, virulência, transporte, etc. Em relação aos resultados obtidos nos ensaios de adesão e invasão, foi evidenciado que, quando as células epiteliais foram inoculadas com nicotina e cotinina, nenhuma diferença significativa na colonização de P. gingivalis foi encontrada. Quando P. gingivalis foi exposta à maior concentração de cotinina, sua capacidade de adesão e invasão às células epiteliais aumentou de forma expressiva (p<0.05; ANOVA - Tukey). No entanto, a nicotina e as outras concentrações de cotinina testadas não alteraram a capacidade de colonização. Esses achados indicam que a nicotina e a cotinina podem afetar a expressão de proteínas de P. gingivalis. Ainda, a cotinina pode alterar positivamente a eficiência de adesão e invasão de P. gingivalis. / Abstract: Cigarette smoking is associated with the development of periodontitis and the decreased response to periodontal therapy. P. gingivalis is an important colonizer of the subgingival biofilm and is one of the major pathogens involved in the initiation and progression of periodontal disease. However, the possible effects of major cigarette's derivatives on P. gingivalis were not fully investigated. Thus, the purpose of the present study was to evaluate the effects of nicotine and cotinine on the protein expression and cellular adhesion and invasion abilities of P. gingivalis. To evaluate protein expression, P. gingivalis W83 cultures were exposed to nicotine and cotinine 6 and 600µg/mL concentrations, the proteins were extracted, separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (12.5% PAGE) and identified with LC-MS/MS. The gels were run in triplicates and detection of proteins was obtained by staining the gels with Coomassie blue. Proteins differentially expressed were digested with trypsin, and the peptide samples sequenced using a Q-TOF API LC-MS/MS system. The MS/MS was searched against the MSDB and NCBI databank using Mascot program. In order to assess P. gingivalis adhesion and invasion abilities, KB cells monolayers and P. gingivalis ATCC 33277 cultures were exposed to 0.1, 10 and 100 µg/mL nicotine and cotinine concentrations. The epithelial cells were incubated for 24 h while P. gingivalis was exposed to these substances until early logarithmic phase. After incubation period, P. gingivalis were submitted to assays to evaluate adhesion to and invasion of KB cells. The number of bacteria associated with these cells was assessed by counting the colony-forming unities. The results from protein expression analyses showed that addition of nicotine and cotinine promoted alterations in proteome profile of P. gingivalis. Among ± 430 protein spots reproducibly detected on each gel, 20 protein spots were downregulated, and 42 were upregulated at least in one treatment (p<0.05; ANOVA - Tukey test). The identified proteins are involved in several processes, i.e. energy production, protein synthesis, oxidative stress, virulence, transport and binding activities. Data obtained from adhesion and invasion assays evidenced that epithelial cells inoculated with nicotine and cotinine did not show any significant differences in P. gingivalis colonization. When P. gingivalis was exposed to the higher concentration of cotinine, adherence and invasion of this bacterium to the epithelial cells markedly increased (p<0.05; ANOVA - Tukey test). However, nicotine and the other concentrations of cotinine did not alter the colonization ability. These findings indicate that nicotine and cotinine may affect P. gingivalis protein expression. In addition, cotinine may alter positively P. gingivalis adhesion and invasion efficiencies. / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

O uso de drogas por mulheres em idade reprodutiva é considerado um grave problema de saúde pública mundial. O mecônio é a primeira excreção do recém-nascido e tem sido utilizado como uma matriz alternativa em análises toxicológicas. A extração em fase sólida (SPE) é um método amplamente utilizado para a purificação e concentração dos analitos em amostras biológicas no campo da análise forense. A maioria dos produtos de SPE convencionais requerem volumes relativamente grandes de solventes levando a um custo acrescido por amostra e um aumento no tempo de processamento da amostra. As ponteiras de extração com fase sólida modificada (DPX) foram utilizadas como uma alternativa aos cartuchos SPE tradicionais. A técnica combina eficiência e rapidez no procedimento de extração, com redução significativa no consumo de solvente e na quantidade de amostra. O objetivo desse estudo foi desenvolver e validar um método para a determinação de nicotina, cotinina, cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno e éster metil anidroecgonina em amostras de mecônio usando DPX e cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC/MS). Os resultados da validação indicaram uma extração eficiente, exata e precisa, com recuperação entre 50-98%, exatidão entre 92-106%, precisão intra-ensaio 4-12% e precisão inter-ensaio 6 a 12%. As curvas de calibração foram lineares com valores de R2 superiores a 0,99; os limites de detecção (LOD) variaram entre 2,5-15 ng/g e os limites de quantificação (LOQ) entre 10-20 ng/g. O método DPX-GC/MS mostrou ser eficaz para análise traços de drogas presentes em amostras de mecônio. Após desenvolvimento e validação, o método foi aplicado em 50 amostras de mecônio coletadas no berçário da Maternidade do Complexo Aeroporto (MATER) na cidade de Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil. / Drug abuse by pregnant women is considered a serious public health problem worldwide. Meconium is the first excretion in newborns and has been used as an alternative matrix to evaluate in utero drug exposure. Solid phase extraction (SPE) is widely employed to prepare and cleanup samples in the field of forensic analysis. Most SPE products require large volumes of solvent, which culminates in longer sample processing times; increased cost per sample and higher limits of detection. Disposable Pipette Extraction tips (DPX) have been used as an alternative to traditional SPE cartridges. They combine efficient and rapid extraction with reduced solvent consumption. The purpose of this study was to develop and validate a method to determine nicotine, cotinine, cocaine, benzoylecgonine, cocaethylene and methyl ester anhydroecgonine in meconium using DPX and GC/MS. Validation results indicated extraction efficiency, ranged between 50-98%, accuracy 92-106%, intra-assay precision 4-12% and inter-assay precision 6 to 12%. Linear calibration curves resulted in R2 values greater than 0.99; limits of detection ranged from 2.5 - 15 ng/g and the limit of quantitation from 10 - 20 ng/g. The DPX-GC/MS method provided to selectively analyze trace concentrations of drugs in meconium samples. Finally, the developed and validated method was applied to 50 meconium samples collected at the nursery of Maternidade do Complexo Aeroporto (MATER) in the city of Ribeirão Preto - São Paulo, Brazil.