Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O gênero Klebsiella faz parte da família Enterobacteriaceae e pode ser encontrado no meio ambiente e nas mucosas de seres humanos e animais. Atualmente, o gênero é composto de cinco espécies, das quais a K. pneumoniae, e mais raramente, a K. oxytoca, são causadoras de infecções. As infecções por K. pneumoniae acometem primordialmente indivíduos hospitalizados, geralmente fragilizados por outras condições, que acabam, na maioria das vezes, desenvolvendo infecções do trato urinário, lesões supurativas, bacteremias e septicemia. Além disso, a K. pneumoniae encontra-se entre as espécies mais comumente implicadas em infecções por microorganismos resistentes a antibióticos, sendo, depois de Escherichia coli, a causa mais comum de septicemia por Gramnegativos. O primeiro estágio da infecção hospitalar por K. pneumoniae consiste na colonização do trato gastrointestinal. A translocação bacteriana (TB), definida como a passagem de bactérias viáveis através da mucosa intestinal, é um processo endógeno que se coloca como hipótese para a ocorrência dessas infecções. A colonização intestinal demanda que as bactérias estejam firmemente estabelecidas na superfície da mucosa para resistir aos movimentos peristálticos do intestino. A proteína CF29K, descrita em uma amostra clínica de K. pneumoniae, é uma adesina não fimbrial que demonstrou mediar uma adesão do tipo difuso em células cultivadas de origem intestinal. Praticamente, não há relatos sobre o papel desta adesina no potencial patogênico de K. pneumoniae. Tampouco há demonstração da capacidade de K. pneumoniae translocar por via intestinal em modelo animal imunologicamente competente e que não apresente lesão da barreira mucosa. O objetivo geral deste trabalho foi estudar o envolvimento da adesina afimbrial CF29K no processo de translocação de K. pneumoniae por via intestinal. O ensaio de TB realizado em modelo in vivo, mostrou que a K. pneumoniae CF504, protótipo de CF29K, é capaz de translocar para linfonodos do mesentério, fígado e baço. Este achado reveste-se de grande consistência na medida em que o modelo de TB empregado não expõe o animal a fatores que levam ao dano da barreira intestinal. A supressão da expressão da adesina CF29K, obtida por mutagênese específica do gene cf29A, da amostra K. pneumoniae CF504, não interferiu na sua capacidade de aderir a células Caco-2, sugerindo que outra(s) adesina(s) também deva desempenhar este papel na amostra selvagem. Da mesma forma, a ausência de CF29K não resultou em menor eficiência de translocação por via intestinal. Além disso, o estudo de 27 amostras clínicas de K. pneumoniae não detectou o gene cf29A em nenhum dos isolados. No entanto, o teste de TB realizado com 15 dessas amostras resultou positivo. Concluise, portanto, que a translocação bacteriana por via intestinal é um processo que independe da adesina CF29K e que deve refletir um possível mecanismo de patogenicidade de K. pneumoniae envolvido, seja na instalação da infecção per se, seja no agravamento de quadros infecciosos sistêmicos já instalados. / Klebsiella is a member of the family Enterobacteriaceae and can be isolated from the environment and from the mucosal surfaces of human beings and animals. There are five known species of Klebsiella, being K. pneumoniae and K. oxytoca the most associated with infections. Mainly hospitalized patients are infected and can present urinary tract infections, supurative lesions, bacteremia, and septicemia. K. pneumoniae strains presenting high resistance to antibiotics are the most common Gram negatives causing septicemia after Escherichia coli. Colonization of the intestinal tract is the first stage in the nosocomial infections by K. pneumoniae. Being so, bacterial translocation (BT), defined as the passage of viable bacteria through the intestinal barrier, is an endogenous process that applies as a hypotheses for the occurrence of those infections. Intestinal colonization demands a firm interaction between the bacteria and the mucosal surface so they can resist to the intestinal peristalses. The CF29K protein discovered in a clinical isolate of K. pneumoniae, is an afimbrial adhesin responsible for diffuse adhesion to intestinal cells in vitro. There is no acknowledge on the role of this adhesin to the pathogenesis of K. pneumoniae, neither on the ability of these bacteria to translocate through the intact intestinal barrier of immunological competent animal models. The aim of this study was to evaluate the involvement of the adhesin CF29K in the BT process. It was shown that CF504, the prototype K. pneumoniae strain for CF29K, is able to translocate trough the intestinal barrier of rats, being recovered from mesenteric lymph nodes, liver, and spleen, after two hours of inoculation. This fact gains importance since the BT assay used causes no physical damage to the intestinal mucosa. The suppression of the CF29K protein expression obtained by site-direct mutagenesis of the cf29A gene of the prototype strain did not change its ability to adherer to Caco-2 cells, suggesting that there might be other (s) adhesin(s) also involved in this interaction. Nevertheless, the absence of CF29K did not abolish the BT capacity of the strain. Besides, the study of 27 clinical isolates of K. pneumoniae did not detect the presence of cf29A gene in any strain. Even so, the BT test carried out with 15 of those isolates resulted positive. We conclude that BT across the intestinal mucosa is a process not related to the adhesin CF29K. We propose that BT may reflect a possible mechanism of pathogenicity of K. pneumoniae involved either in the installation of the infection, or in the worsening of already installed systemic infection. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientadores: Francisco Carlos Groppo, Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-12T19:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cogo_Karina_D.pdf: 3355648 bytes, checksum: d8afd799c6d162cda6cbb9bad9d225a5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O uso do cigarro tem sido associado com a progressão da periodontite bem como com a redução da resposta à terapia aplicada a essa doença. Porphyromonas gingivalis é um importante colonizador do biofilme subgengival além de ser um dos principais patógenos envolvidos no estabelecimento e progressão da doença periodontal. No entanto, os possíveis efeitos dos principais derivados do cigarro sobre P. gingivalis ainda não foram totalmente investigados. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da nicotina e cotinina sobre a expressão de proteínas e sobre a capacidade de adesão e invasão celular de P. gingivalis. A fim de avaliar a expressão de proteínas, culturas de P. gingivalis W83 foram expostas à nicotina e cotinina nas concentrações de 6 e 600µg/mL, as proteínas foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (12.5% SDS-PAGE) e identificadas por LC-MS/MS. Os géis e suas corridas eletroforéticas foram feitas em triplicatas e a detecção de proteínas nos mesmos foi feita através de coloração com corante Coomassie. Proteínas diferentemente expressas foram digeridas com tripsina e as amostras de peptídeos sequenciadas utilizando um sistema Q-TOF API LC-MS/MS. A busca MS/MS foi realizada utilizando os bancos de dados MSDB e NCBI através do programa Mascot. Para examinar a capacidade de adesão e invasão de P. gingivalis, monocamadas de células KB e culturas de P. gingivalis ATCC 33277 foram expostas às concentrações de 0.1, 10 e 100 µg/mL de nicotina e cotinina. As células epiteliais foram incubadas por 24 h enquanto P. gingivalis foi exposta a essas substâncias até atingir a fase logarítmica. Após o período de incubação, P. gingivalis foi submetida aos ensaios de adesão e invasão às células KB. O número de bactérias associadas às células foi obtido através de contagem de unidades formadoras de colônia. Os resultados obtidos da análise expressão de proteínas mostraram que a adição de nicotina e cotinina promoveram alterações no proteoma de P. gingivalis. Entre os ± 430 spots de proteínas reproduzíveis detectados em cada gel, 20 proteínas foram menos expressas e 42 foram mais expressas em pelo menos um dos tratamentos (p<0.05; ANOVA - Tukey). Entre as proteínas identificadas, muitas estavam envolvidas em processos como produção de energia celular, síntese de proteínas, estresse oxidativo, virulência, transporte, etc. Em relação aos resultados obtidos nos ensaios de adesão e invasão, foi evidenciado que, quando as células epiteliais foram inoculadas com nicotina e cotinina, nenhuma diferença significativa na colonização de P. gingivalis foi encontrada. Quando P. gingivalis foi exposta à maior concentração de cotinina, sua capacidade de adesão e invasão às células epiteliais aumentou de forma expressiva (p<0.05; ANOVA - Tukey). No entanto, a nicotina e as outras concentrações de cotinina testadas não alteraram a capacidade de colonização. Esses achados indicam que a nicotina e a cotinina podem afetar a expressão de proteínas de P. gingivalis. Ainda, a cotinina pode alterar positivamente a eficiência de adesão e invasão de P. gingivalis. / Abstract: Cigarette smoking is associated with the development of periodontitis and the decreased response to periodontal therapy. P. gingivalis is an important colonizer of the subgingival biofilm and is one of the major pathogens involved in the initiation and progression of periodontal disease. However, the possible effects of major cigarette's derivatives on P. gingivalis were not fully investigated. Thus, the purpose of the present study was to evaluate the effects of nicotine and cotinine on the protein expression and cellular adhesion and invasion abilities of P. gingivalis. To evaluate protein expression, P. gingivalis W83 cultures were exposed to nicotine and cotinine 6 and 600µg/mL concentrations, the proteins were extracted, separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (12.5% PAGE) and identified with LC-MS/MS. The gels were run in triplicates and detection of proteins was obtained by staining the gels with Coomassie blue. Proteins differentially expressed were digested with trypsin, and the peptide samples sequenced using a Q-TOF API LC-MS/MS system. The MS/MS was searched against the MSDB and NCBI databank using Mascot program. In order to assess P. gingivalis adhesion and invasion abilities, KB cells monolayers and P. gingivalis ATCC 33277 cultures were exposed to 0.1, 10 and 100 µg/mL nicotine and cotinine concentrations. The epithelial cells were incubated for 24 h while P. gingivalis was exposed to these substances until early logarithmic phase. After incubation period, P. gingivalis were submitted to assays to evaluate adhesion to and invasion of KB cells. The number of bacteria associated with these cells was assessed by counting the colony-forming unities. The results from protein expression analyses showed that addition of nicotine and cotinine promoted alterations in proteome profile of P. gingivalis. Among ± 430 protein spots reproducibly detected on each gel, 20 protein spots were downregulated, and 42 were upregulated at least in one treatment (p<0.05; ANOVA - Tukey test). The identified proteins are involved in several processes, i.e. energy production, protein synthesis, oxidative stress, virulence, transport and binding activities. Data obtained from adhesion and invasion assays evidenced that epithelial cells inoculated with nicotine and cotinine did not show any significant differences in P. gingivalis colonization. When P. gingivalis was exposed to the higher concentration of cotinine, adherence and invasion of this bacterium to the epithelial cells markedly increased (p<0.05; ANOVA - Tukey test). However, nicotine and the other concentrations of cotinine did not alter the colonization ability. These findings indicate that nicotine and cotinine may affect P. gingivalis protein expression. In addition, cotinine may alter positively P. gingivalis adhesion and invasion efficiencies. / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:02:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaSilva_LiviaPilattiMendes_M.pdf: 1602121 bytes, checksum: 21e5b9daa8ce74359c48e82c96cf7a13 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves causam doenças extraintestinais em aves, levando a perdas econômicas consideráveis para a indústria avícola em todo o mundo. Fatores de virulência ainda não conhecidos podem apresentar papéis importantes na patogenicidade, os quais podem ser significativos para o desenvolvimento de medidas de controle de processos infecciosos dessas linhagens. Invasinas permitem que o patógeno invada células hospedeiras, sobrepujando as defesas do hospedeiro, por interagir com receptores específicos na superfície celular. Baseando-se em análises do genoma da linhagem APEC SEPT362, detectou-se a presença de uma provável invasina, homóloga ao gene ychO, ainda não caracterizado, da linhagem E. coli str. K-12 substr. MG1655, sendo seu efeito na patogenicidade estudado. Neste trabalho, a linhagem SEPT362 deficiente para ychO reduziu a taxa de mortalidade em pintos, a adesão a células de fibroblasto de embrião de galinha (FEG), a invasão em células fibroblasto de embrião de galinha (CEC-32), a sobrevivência em macrófagos de aves (HD11), a formação de biofilme e a motilidade. Esses resultados sugerem, pela primeira vez, que o gene ychO codifica para uma invasina e que tem papel na patogenicidade da linhagem APEC SEPT362. Além dos diversos fatores de virulência, o estudo de diferentes tipos de sinais extracelulares que medeiam a comunicação entre bactérias e regulam a expressão gênica abre grandes possibilidades no estudo de mecanismos de patogenicidade e possíveis meios de interferir nos mesmos, transformando organismos patogênicos em organismos não virulentos. Quorum sensing (QS) é um mecanismo dependente da densidade celular bacteriana que as permitem agir como complexos multicelulares, aumentando suas chances de sobrevivência no meio ambiente. O sistema QS autoindutor 2 (AI-2) é um sistema de comunicação universal de bactérias mediado pelo AI-2, produzido pela ação da enzima LuxS. O sistema QS autoindutor 3 (AI-3) é um sistema que pode também mediar a comunicação entre reinos, sendo regulado pela hisitidina quinase QseC. Neste contexto, mutantes para os genes luxS e qseC foram construídos na linhagem SEPT362. A linhagem deficiente para luxS apresentou uma redução significativa na adesão a células FEG, devido a um papel do gene na regulação da fímbria do tipo 1. A linhagem deficiente para qseC teve uma menor taxa de mortalidade em pintos e uma redução significativa na adesão a células FEG, pela falta da fímbria do tipo 1 no mutante / Abstract: Avian pathogenic Escherichia coli strains cause extraintestinal diseases in poultry, leading to substantial economic losses to the poultry industry worldwide. Virulence factors not yet known may play important roles in pathogenicity, which may be significant for measures control development of infectious processes of these strains. Invasins allow the pathogen to invade host cells, overcoming host defenses by interacting with specific cell surface receptors. Based on analysis of APEC SEPT362 strain genome detected the presence of a putative invasin gene homologous to ychO, not yet characterized, of E. coli str. K-12 substr. MG1655, and its effect on pathogenicity was studied. In this work, the SEPT362 strain deficient for ychO reduced the mortality rate in chicks, the adherence to chicken embryo fibroblast (CEF) cells, the invasion of chicken embryo cells (CEC-32), the survival in poultry macrophages (HD11), the motility and biofilm formation. These results suggest, for the first time, that ychO gene encodes for an invasin and plays a role in APEC SEPT362 pathogenicity. In addition to the many virulence factors, the study of different types of extracellular signals that mediate communication between bacteria and regulate gene expression opens up great possibilities to study pathogenic mechanisms and possible ways to interfere in it, transforming pathogenic organisms into non-virulent organisms. Quorum sensing (QS) is a mechanism dependent on the bacterial cell density that enables them to act as multicellular complexes, increasing their chances of survival in the environment. The QS system autoinducer 2 (AI- 2) is a universal communication system of bacteria mediated by AI- 2 produced by the action of the enzyme LuxS. The QS system autoinducer 3 (AI- 3) is a system that can also mediate communication between realms, being regulated by kinase QseC. In this context, mutants for the luxS and qseC genes were built in SEPT362 strain. The strain deficient for luxS showed a significant reduction in CEF cell adhesion due to a role in the regulation of gene type 1 fimbriae. The deficient strain for qseC had a lower rate of mortality in chicks and a significant reduction in cell adhesion to CEF, due to a lack of type 1 fimbriae in the mutant / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular