No universo da pecuária leiteira, a mastite representa um importante desafio, sendo responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com redução na produção de leite. O gênero Staphylococcus assume elevada importância como agente etiológico das mastites devido à sua ampla distribuição e freqüência de ocorrência. Foram coletadas amostras de leite de fêmeas bovinas com mastite subclínica para exames microbiológicos e contagem de células somáticas (CCS). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, as amostras positivas foram submetidas a análises das medianas das CCS, testes de susceptibilidade \"in vitro\" frente a diferentes antimicrobianos, assim como pesquisa de genes codificadores das adesinas - genes que codificam para proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebp), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (fnbA), proteína B ligadora de fibronectina (fnbB) e proteína associada à formação de biofilme (bap), por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com os achados do presente estudo, dentre as bactérias do gênero Staphylococcus isoladas, os S. aureus foram verificados com maior freqüência, seguido por Staphylococcus coagulase-negativos - S. intermedius, S. chromogens e S. warneri. Com respeito às medianas das CCS, o gênero Streptococcus spp. apresentou o maior valor. O perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos testados foi semelhante entre as espécies de Staphylococcus coagulase-positivos e negativos, sendo os antimicrobianos cefalexina, cefalotina e ceftiofur os que apresentaram maior frequência de sensibilidade, e penicilina, amoxicilina e ampicilina os que apresentaram maior resistência. Com exceção do (fnbA), todos os outros fatores de virulência estudados foram detectados, sendo os genes eno, fib e a associação dos genes \"eno/fib/bap\" os mais freqüentemente detectados. Nas amostras coletadas dos tanques de refrigeração não foram detectadas todas as espécies de Staphylococcus spp. isoladas dos quartos mamários. Tais informações acerca do assunto permitem o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de tratamento e controle desta enfermidade, possibilitando o aumento da produtividade leiteira. / In the world of dairy cattle, mastitis is a major challenge, accounting for economic losses related mainly to reduction in milk production. The genus Staphylococcus assumes greater importance as a etiologic agent of mastitis due to its wide distribution and frequency of occurrence. Milk samples were collected from cows with subclinical mastitis to microbiological examinations and somatic cell count (SCC). After isolation and identification of microorganisms, positive samples were analyzed for the medians of SCC, tested for susceptibility \"in vitro\" against different antimicrobials and polymerase chain reaction will be used to search for genes encoding adhesins - genes that code for collagen-binding protein (cna), lamininbinding protein (eno), elastin-binding protein (ebp), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA), fibronectin-binding protein B (fnbB) and protein associated with biofilm formation (bap). According to the findings of this study, among the bacteria of the genus Staphylococcus isolated, S. aureus were found most frequently, followed by coagulase-negative Staphylococcus - S. intermedius, S. chromogens and S. warneri. With respect to the medians of CCS, the genus Streptococcus spp. showed the highest. The profile of sensitivity and resistance to antimicrobials was similar among species of coagulase-positive and negative Staphylococcus, and antimicrobial cephalexin, cephalothin, and ceftiofur showed higher frequency sensitivity. Penicillin, amoxicillin and ampicillin showed the highest resistance. With the exception of (fnbA), all other virulence factors were detected, with genes eno, fib and the association of genes \"eno/fib/bap\" the most frequently detected. The samples collected from the cooling tanks were not detected all species of Staphylococcus spp. that were isolated from the mammary glands. Such information on the subject allow the development of more efficient strategies for treatment and control of this disease, allowing for increased milk production.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-11T18:26:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoFenotipicaMoleculas.pdf: 2228766 bytes, checksum: 4c3cd527165e56f0d24fca2bd0532ff3 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-25T13:48:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoFenotipicaMoleculas.pdf: 2228766 bytes, checksum: 4c3cd527165e56f0d24fca2bd0532ff3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-25T13:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoFenotipicaMoleculas.pdf: 2228766 bytes, checksum: 4c3cd527165e56f0d24fca2bd0532ff3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introdução: A infecção causada pelo Micobacterium leprae leva a uma complexa relação entre o parasito e o hospedeiro, baseada principalmente nos aspectos imunopatológicos, que podem resultar na forma virchoviana, apresentando um perfil de células Th2, ou no pólo tuberculóide que apresenta um padrão imunológico Th1. Justificativa: Neste processo se fez necessário analisar participação do endotélio através do perfil de expressão de moléculas de adesão, buscando assim o entendimento de como a migração celular ocorre na hanseníase. Objetivo Geral: determinara o perfil da expressão de moléculas de adesão e a participação do endotélio na seleção de células para a formação do infiltrado inflamatório visto na doença. Objetivos específicos: quantificar a expressão das moléculas de adesão ICAM-1; ICAM-2, VCAM-1; VLA-4; E-selectina; P-selectina. Analisar a expressão das moléculas de adesão de acordo com o tipo ao padrão do infiltrado histopatológico nos polos da doença. Avaliar de forma quantitativa a presença das moléculas de adesão e correlacionar estas adesinas com os diferentes padrões celulares vistos nos polos da infecção. Metodologia: as amostras de pele foram seccionadas e as porções retiradas foram submetidas a análise imunohistoquímica através de anticorpos monoclonais contra os marcadores ICAM-1; ICAM-2 ; VCAM-1; VLA-4; P-selectina e a E-selectina. Resultados: A imunomarcação das adesinas ICAM-1, VCAM-1 e VLA-4 demonstravam uma maior presença destas moléculas no endotélio da forma tuberculóide (TT) da infecção. O ICAM-1 apresentou-se com 9,92±1,11 células/mm2 na forma TT, enquanto que o polo LL apresentou 5,87±1.01 células/ mm2. O VCAM-1 apresentou uma média 18,28±1,46 células/mm2 na forma TT, enquanto o virchoviana apresentou em média 10,67±1,25 células/ mm2. A análise da E-Selectina demonstrou que no polo tuberculóide da infecção há uma quantidade (13,00±1.59 células/mm2), significativamente (p<0.0001) maior da E-Selectina em comparação ao polo virchoviano que apresentou apenas 2,58±0.38 células/mm2. Discussão: o aumento das imunoglobulinas ICAM-1 e VCAM-1 resultam no fortalecimento da sinalização de transmigração tecidual, através da relação entre o LFA-1 com o seu ligante endotelial o ICAM-1. Este mesmo mecanismo está envolvido no fortalecimento da relação entre o endotélio e migração de células com o perfil de Th1 em direção ao tecido. O VLA-4 estar diretamente ligado a infiltração de células da linhagem Th1, sendo o mediador do aumento da presença de células T CD4+ no tecido inflamado. A falta do VLA-4, e da imunoglobulina VCAM-1 pode resultar também em uma inibição da adesão de linfócitos Th1. Devemos ressaltar ainda que a deficiência do ICAM-1 e do VCAM-1 influencia a migração dos linfócitos T CD8+ modificando assim a presença de células citotóxicas no tecido. Conclusão: o estudo fortalece o papel do endotélio como um dos responsáveis pelo perfil de células encontradas no tecido. Correlacionando a expressão das moléculas de adesão a seletividade na migração de células, o que resulta em uma influencia direta sobre a resposta imunológica presente na hanseníase. / Introduction: The infection caused by Mycobacterium leprae leads to a complex relationship parasite-host relationship based mainly on immunopathological aspects, that may result in lepromatous form, preseting a Th2 cell profile, or in the tuberculoid pole presenting a Th1 immune pattern. Rationale: In this process it was necessary to analyze the participation of the endothelium through expression profile of adhesion molecules, thus trying to understand how cell migration occurs in leprosy. Main Objective: the study will determine the profile of expression of adhesion molecule and the participation of the endothelium in the selection of cells to the formation of the inflammatory infiltrate seen in the disease. Specific objectives: to quantify the expression of the adhesion molecules ICAM-1; ICAM-2, VCAM-1; VLA-4; E-selectin; P-selectin. To analyze the expression of adhesion molecules according to the standard histopathological type infiltrate the poles of the disease. Quantitatively evaluate the presence of adhesion molecules and correlate these adhesins with different cell patterns seen at the poles of the infection. Methodology: The skin samples were sectioned taken portions were subjected to immunohistochemical analysis using monoclonal antibodies to ICAM-1; ICAM-2; VCAM-1; VLA-4; P-selectin and E-selectin markers. Results: immunostaining of ICAM-1, VCAM-1 and VLA-4 adhesins, showed a greater presence of these molecules on the endothelium of the tuberculoid form (TT) of the infection. ICAM-1 was presented with 9.92±1.11 cells/mm2 on TT form, whereas LT pole showed 5.87±1.1 cells/mm 2. The VCAM-1 averaged 18.28±1.46 cells/mm2 in TT form, while the lepromatous had on average 10.67±1.25 cells/mm2. The analysis of E-Selectin showed that the infection tuberculoid is present in an amount (13.00±1:59 cells/mm2), significantly (p <0.0001) higher than E-selectin when compared to lepromatous pole which had only 2.58±0:38 cells/mm2. Discussion: The increase quantity of immunoglobulins ICAM-1 and VCAM-1 result in strengthening the signaling of transmigration tissue through the relationship between LFA-1 with its endothelial connector ICAM-1. This same mechanism is involved in strengthening the relationship between the endothelium and migration of cells with Th1 profile towards the tissue. VLA-4 is directly linked to the infiltration of Th1 cell lines, being the mediator of the increased frequency of T CD4+ cells in inflamed tissue. The lack of VLA-4 and of VCAM-1 immunoglobulin can also result in inhibition of adhesion of Th1 lymphocytes. It is also important to notice that the ICAM-1 and VCAM-1 deficiency influences the migration of T CD8+ lymphocytes thus altering the presence of cytotoxic cells in the tissue. Conclusion: The study strengthens the role of the endothelium as one responsible for the profile found in tissue cells. Correlating the expression of adhesion molecules to the selectivity in cell migration, resulting in a direct influence on the immune response present in leprosy.

No universo da pecuária leiteira, a mastite representa um importante desafio, sendo responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com redução na produção de leite. O gênero Staphylococcus assume elevada importância como agente etiológico das mastites devido à sua ampla distribuição e freqüência de ocorrência. Foram coletadas amostras de leite de fêmeas bovinas com mastite subclínica para exames microbiológicos e contagem de células somáticas (CCS). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, as amostras positivas foram submetidas a análises das medianas das CCS, testes de susceptibilidade \"in vitro\" frente a diferentes antimicrobianos, assim como pesquisa de genes codificadores das adesinas - genes que codificam para proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebp), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (fnbA), proteína B ligadora de fibronectina (fnbB) e proteína associada à formação de biofilme (bap), por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com os achados do presente estudo, dentre as bactérias do gênero Staphylococcus isoladas, os S. aureus foram verificados com maior freqüência, seguido por Staphylococcus coagulase-negativos - S. intermedius, S. chromogens e S. warneri. Com respeito às medianas das CCS, o gênero Streptococcus spp. apresentou o maior valor. O perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos testados foi semelhante entre as espécies de Staphylococcus coagulase-positivos e negativos, sendo os antimicrobianos cefalexina, cefalotina e ceftiofur os que apresentaram maior frequência de sensibilidade, e penicilina, amoxicilina e ampicilina os que apresentaram maior resistência. Com exceção do (fnbA), todos os outros fatores de virulência estudados foram detectados, sendo os genes eno, fib e a associação dos genes \"eno/fib/bap\" os mais freqüentemente detectados. Nas amostras coletadas dos tanques de refrigeração não foram detectadas todas as espécies de Staphylococcus spp. isoladas dos quartos mamários. Tais informações acerca do assunto permitem o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de tratamento e controle desta enfermidade, possibilitando o aumento da produtividade leiteira. / In the world of dairy cattle, mastitis is a major challenge, accounting for economic losses related mainly to reduction in milk production. The genus Staphylococcus assumes greater importance as a etiologic agent of mastitis due to its wide distribution and frequency of occurrence. Milk samples were collected from cows with subclinical mastitis to microbiological examinations and somatic cell count (SCC). After isolation and identification of microorganisms, positive samples were analyzed for the medians of SCC, tested for susceptibility \"in vitro\" against different antimicrobials and polymerase chain reaction will be used to search for genes encoding adhesins - genes that code for collagen-binding protein (cna), lamininbinding protein (eno), elastin-binding protein (ebp), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA), fibronectin-binding protein B (fnbB) and protein associated with biofilm formation (bap). According to the findings of this study, among the bacteria of the genus Staphylococcus isolated, S. aureus were found most frequently, followed by coagulase-negative Staphylococcus - S. intermedius, S. chromogens and S. warneri. With respect to the medians of CCS, the genus Streptococcus spp. showed the highest. The profile of sensitivity and resistance to antimicrobials was similar among species of coagulase-positive and negative Staphylococcus, and antimicrobial cephalexin, cephalothin, and ceftiofur showed higher frequency sensitivity. Penicillin, amoxicillin and ampicillin showed the highest resistance. With the exception of (fnbA), all other virulence factors were detected, with genes eno, fib and the association of genes \"eno/fib/bap\" the most frequently detected. The samples collected from the cooling tanks were not detected all species of Staphylococcus spp. that were isolated from the mammary glands. Such information on the subject allow the development of more efficient strategies for treatment and control of this disease, allowing for increased milk production.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados. / The dimorphic fungus Sporothrix schenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a deep mycosis that presents different clinical manifestations. The diverse manifestations of this and other infections can be related the host immunity, virulence factors or different genotypes of the pathogen. Previous data of our group demonstrated that differences in the expression of adhesins to fibronectin are directly related to the virulence of the different strains of S. schenckii. In the present work we have evaluated the morphological, biochemical and genotypic characteristics of twelve strains of S. schenckii (isolated from human and cat cases of sporotrichosis and from environment) from different geographic regions that present distinct virulence levels. The mycelium and yeast phases of each strain were morphologically analyzed. The strains has presented the typical morphology, with thin and septated hyphae. The conidia exhibited obovoidal or ovoidal elongated form. The yeast phase presented the ovoid or elongated cell form. Furthermore, we have verified the adhesins expression to fibronectin, to laminin, to gp70 antigen and to the antigenic bands pattern of all protein extracts, recognized by patients or infected mice sera antibodies. For this, the proteins were extracted from the surface of each strain yeast phase and assayed by Western blot technique. We have observed that the most virulent strains of S. schenckii expressed more adhesins to fibronectin and to laminina than less virulent strains. The presence of the gp70 was confirmed in ten isolates of twelve. Just strains isolated from infected cats did not present this glycoprotein. The antigenic bands pattern was variable between the different extracts, with no clear correlation with origin or geographical distribution of the isolates of S. schenckii. In order to cross phenotypic and genotypic data we have sequenced the calmodulin loci (CAL) and the Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) in order to check if there was differences between the strains studied. In this analysis we found that this strains are divided in two species, S. schenckii and S. brasiliensis, again with no correlation with the geographical distribution. Our study reinforces the hypothesis on the correlation between adhesins expression pattern and virulence levels with no connection among geographical distribution or genotype of the different strains of S. schenckii.

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_MelinaAparecida_M.pdf: 3889960 bytes, checksum: 3e92b071b7e108ebb8bff09fe751b180 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O Resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The Abstract is available with the full electronic digital document / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Leptospirose é uma doença infecciosa emergente cujos agentes etiológicos são espécies patogênicas do gênero Leptospira. Leptospiras patogênicas possuem inúmeros genes específicos codificando proteínas com funções desconhecidas, sugerindo que as leptospiras apresentam fatores de virulência únicos. Adesinas bacterianas são importantes fatores de virulência e, assim, a identificação de adesinas conservadas em espécies patogênicas de Leptospira pela construção de bibliotecas genômicas expostas na superfície de bacteriófagos (shotgun phage display), seguida por seleção em células e/ou componentes da matriz extracelular (biopanning), pode revelar novos antígenos e alvos para o tratamento e prevenção da leptospirose. Bibliotecas foram construídas com o DNA genômico de L. interrogans fragmentado e o fagomídeo pG8SAET, sendo testadas algumas abordagens para clonagem como a ligação entre extremidades cegas (blunt-end) e técnicas baseadas em ligação entre extremidades coesivas, incluindo a obtenção de ORESTES e a utilização de adaptadores em grampo. Apesar de serem encontradas algumas limitações, a clonagem por ligação blunt-end se mostrou a mais eficiente para a construção de bibliotecas, sendo adotada para a construção de três bibliotecas em maior escala. A seleção de novas possíveis adesinas a partir das bibliotecas construídas foi realizada em células eucarióticas através da metodologia BRASIL. A primeira biblioteca (BBT1) exibiu 106 clones totais, a partir da qual foram selecionados quatro proteínas em fase apenas com a proteína VIII do fago (pVIII). No entanto, nenhuma delas seria exposta por programas de predição na bactéria. Outras duas bibliotecas foram construídas (BBT2 e BBT3), as quais obtiveram um número ideal de clones para uma ampla cobertura do genoma (>2x107 clones). Por apresentar maior proporção de clones válidos, a BBT2 foi utilizada para a seleção de adesinas, resultando em onze clones em fase com pVIII e/ou sequência sinal do fago. Análises por programas de predição revelaram três proteínas hipotéticas, denominadas LepA962, LepA069 e LepA388, as quais poderiam estar expostas ou ser secretadas pela bactéria, sugerindo uma possível função de adesina. O estudo da proteína LepA388 levou ao reconhecimento de outras doze proteínas semelhantes e pertencentes a uma família paráloga contendo um domínio denominado DUF_61, motivo de função desconhecida presente em proteínas compartilhadas somente entre as espécies patogênicas mais virulentas de Leptospira. Por esta razão, a proteína LepA388 foi a mais estudada. A clonagem de três porções da proteína (LepA388P, LepA388NR e LepA388F) para expressão heteróloga resultou em proteínas recombinantes insolúveis e, considerando a riqueza em resíduos de cisteína presente em sua estrutura, não foi possível renaturá-las adequadamente. Diante dos obstáculos encontrados, apenas a porção contendo a sequência apresentada pelo fago (LepA388P) foi utilizada para obtenção de antissoros em camundongos, os quais apresentaram altos títulos, demonstrando a alta imunogenicidade da proteína LepA388P. O reconhecimento de proteínas nativas da família paráloga DUF_61 em extratos de diferentes sorovares de Leptospira não foi observado, assim como sua expressão in vitro a partir de bactérias em diferentes condições de cultivo. Estudos adicionais sobre a expressão in vivo e funções dos membros desta família são necessários para uma compreensão mais ampla de seu papel na biologia de leptospiras e, possivelmente, na patogênese da leptospirose. / Leptospirosis is an emerging infectious disease whose etiologic agents are pathogenic species of the genus Leptospira. Pathogenic leptospires have countless specific genes encoding proteins with unknown functions, suggesting that leptospires have unique virulence factors. Bacterial adhesins are important virulence factors and so the identification of conserved adhesins in pathogenic Leptospira species from shotgun phage display libraries, followed by selection (biopanning) in cells and/or extracellular matrix components, can reveal new antigens and strategies for leptospirosis treatment and prevention. Libraries were constructed using fragmented genomic DNA from L. interrogans and pG8SAET phagemid vector. Cloning approaches included blunt-end ligation and techniques based in cohesive-end ligation, such as ORESTES strategy and hairpin linkers. Despite some limitations, cloning by blunt-end ligation was the most efficient for library construction, being adopted for the construction of three libraries on a larger scale. Selection of new possible adhesins was performed by biopanning of the libraries in eukaryotic cells through BRASIL methodology. The first library called BBT1 exhibited approximately 106 total clones, and its biopanning resulted in four proteins fused to phage protein VIII, but none of them were expected to be exposed by the bacteria. Other libraries were built (BBT2 and BBT3) which reached the expected number of clones to obtain a larger genome representation (> 2x107 clones). Since it showed the highest proportion of positive clones, BBT2 was selected to perform a second biopanning, resulting in eleven proteins fused to phage protein VIII and/or signal peptide. In silico analysis revealed three hypothetical proteins, named LepA962, LepA069 and LepA388, that would be exposed or secreted by the bacteria, suggesting a possible adhesin function. The study of LepA388 protein led to the recognition of twelve other similar proteins belonging to a paralogous family that contains a domain called DUF_61, domain of unknown function that is present in proteins shared only among the most virulent pathogenic species of Leptospira. For this reason, the LepA388 protein was the most studied. The cloning of three portions of the protein (LepA388P, LepA388NR and LepA388F) for heterologous expression resulted in insoluble recombinant proteins, and given the presence of many cysteine residues in its structure, it was not possible to renature them appropriately. In face of the imposed obstacles, only the portion containing the sequence presented by the bacteriophage (LepA388P) was used to obtain antisera in mice, which showed high titers, demonstrating the high immunogenicity of the protein LepA388P. Recognition of native DUF_61 paralogous family proteins in extracts from distinct Leptospira serovars was not observed, as well as its in vitro expression from bacteria cultured in different conditions. Additional studies on the in vivo expression and functions of members of this family are needed for a broader understanding of their role in leptospiral biology and possibly in the pathogenesis of leptospirosis.

Gram-negativas e é utilizado por diversos patógenos para colonizar seus hospedeiros, sendo o primeiro passo do processo de desenvolvimento do biolfilme. Uma variedade de apêndices celulares e proteínas está envolvida na adesão bacteriana, tais como pili, fimbrias, adesinas fimbriais e afimbriais. O fitopatógeno Xylella fastidiosa, agente causal de importantes doenças como a doença de Pierce de videiras, a clorose variegada dos citros e a síndrome do rápido declínio de oliveiras, possui em sua superfície várias dessas estruturas que são potencialmente responsáveis pela colonização eficiente de insetos-vetores e plantas hospedeiras. Entre as adesinas afimbriais codificadas no genoma dessa bactéria, três XadA (XadA1, Hsf/XadA2 e XadA3) são classificadas como autotransportadores triméricos. Dados da literatura sugerem que XadA1 e XadA2 são importantes para a formação do biofilme, porém a função de XadA3 ainda não havia sido investigada. Nesse trabalho, tivemos como objetivo caracterizar bioquímica e funcionalmente a proteína XadA3 e obter informações adicionais sobre o papel desempenhado por XadA1 e XadA2 na adesão e virulência de X. fastidiosa. Utilizando imunodetecção com um anticorpo policlonal anti-XadA3 por nós obtido, demonstramos que essa proteína localiza-se na superfície bacteriana e medeia a adesão intercelular. A caracterização dos fenótipos de mutantes de deleção de cada um dos genes das adesinas XadA revelou que o mutante &#916;xadA3 tem reduzida capacidade de agregação celular e formação de biofilme quando comparado tanto aos mutantes &#916;xadA1 e &#916;xadA2 como à cepa selvagem Temecula. A deleção dos genes xadA afeta marginalmente o perfil de expressão gênica global avaliado através de RNAseq das cepas mutantes comparativamente à cepa selvagem, porém destaca-se, nas cepas mutantes, o aumento nos níveis dos transcritos de lipases/esterases. Já foi descrito que essas enzimas parecem atuar na degradação do tecido vegetal associada aos sintomas da doença de Pierce de videiras. A deleção de xadA3 resulta em um fenótipo de hipervirulência em videiras, mas também de deficiência de transmissão pelo inseto-vetor. O conjunto dos resultados obtidos nesse trabalho evidenciam o importante papel desempenhado pelas adesinas XadAs, particularmente XadA3, na adesão intercelular, no desenvolvimento do biofilme e na virulência de X. fastidiosa. / Adhesion is a widely conserved mechanism of virulence among Gram-negative bacteria that is used by several pathogens to colonize their hosts, being the first step in biolfilm development. A variety of appendages and proteins are involved in bacterial adhesion, such as pili, fimbriae, fimbrial and afimbrials adhesins. The phytopathogen Xylella fastidiosa, causal agent of important diseases such as Pierce\'s disease of grapevines, citrus variegated chlorosis and olive quick decline syndrome, harbours on its surface several of these structures that are potentially responsible for efficient colonization of insect vectors and plant hosts. Among the afimbrial adhesins encoded in the genome of this bacterium, three XadAs (XadA1, Hsf/XadA2 and XadA3) are classified as trimeric autotransporters. Data from the literature suggest that XadA1 and XadA2 are important for biofilm formation, but XadA3 function has not been yet investigated. In this work, we aimed to biochemically and functionally characterize the XadA3 protein and gather additional information about the role played by XadA1 and XadA2 in X. fastidiosa adhesion and virulence. Using immunodetection with a polyclonal anti-XadA3 antibody, we have demonstrated that this protein localizes to the bacterial surface and mediates intercellular adhesion. Phenotypic characterization of the deletion mutants of XadA adhesins encoded genes revealed that the &#916;xadA3 mutant has reduced cell aggregation capacity and biofilm formation when compared to both &#916;xadA1 and &#916;xadA2 mutants as well as to Temecula wild type strain. Deletion of the xadA genes marginally affects the global gene expression profile assessed by RNA-seq of the mutant strains compared to the wild-type strain, eventhough an increase in lipase/esterase transcripts levels was observed in the mutant strains. It has been reported that these enzymes appear to participate in the degradation of plant tissue that is associated with symptoms of Pierce\'s disease of grapevines. The deletion of xadA3 results in a phenotype of hypervirulence in grapevines but also of deficiency in insect-vector transmission. The results obtained in this work evidenced the important role played by XadAs adhesins, particularly XadA3, in X. fastidiosa intercellular adhesion, biofilm development and virulence.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Sarah Veloso Nogueira.pdf: 4968384 bytes, checksum: 1a3070a4c2260fba10919cd4f6ccd4f4 (MD5) Previous issue date: 2010-03-11 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a human systemic mycosis, prevalent in Latin America. Extracellular matrix (ECM) is a complex net where collagens, laminin and fibronectin can be found and, when exposed, is the first site for the fungus adhesion. Our aim was to study genes involved in the adhesion process using Representational Difference Analysis (RDA). RDA is a PCR-coupled subtractive method that allows the isolation of genes differentially expressed in two different cDNA populations. Hence, cDNAs were synthesized from RNAs extracted from P. brasiliensis yeast cells adhered to collagen and fibronectin to identify overexpressed genes. Genes involved in a wide range of cellular process were found and PbCtr3 (cooper transporter) and enolase (PbEno) were chosen to further studies. A synthetic peptide (PbCTR3) and the recombinant enolase (rPbEno) were utilized together with the anti-rPbEno polyclonal antibody in functional analysis with ECM components and plasminogen. The studies suggest that P. brasiliensis enolase, in the surface, is able to generate plasmin from plasminogen by plasminogen activator. Therefore, it was also demonstrated that this protein is secreted and able to promote fungus adhesion and invasion to cells. These findings clearly establish the role of enolase in the patogenicity of P. brasiliensis. / Paraccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente na América Latina. A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa formada por colágeno, laminina, fibronectina, entre outros componentes, que, quando exposta, é o local inicial de adesão do fungo. Nosso objetivo foi estudar genes envolvidos nesse processo de adesão utilizando Análise Diferencial Representacional (RDA). RDA é um método de subtração acoplado a PCR que permite o isolamento de genes diferencialmente expressos entre duas populações de cDNAs diferentes. Assim, cDNAs foram sintetizados a partir de RNAs extraídos de células leveduriformes de P. brasiliensis aderidos à colágeno e fibronectina para identificar genes super-expressos nestas condições. Genes envolvidos com vários processos celulares foram observados e PbCtr3 (transportador de cobre) e enolase (PbEno) foram escolhidos para análises adicionais. Um peptídeo sintético (PbCTR3) e a proteína recombinante (rPbEno) foram utilizados, juntamente com o anticorpo policlonal antirPbEno em análises funcionais com componentes da MEC e plasminogênio. Os estudos sugerem que a enolase de P. brasiliensis, localizada na parede celular, é capaz de gerar plasmina a partir do plasminogênio mediada pelo ativador de plasminôgenio. Além disso, foi também demonstrado que esta proteína é secretada sendo capaz de promover a adesão e invasão do fungo a células. Esses estudos claramente estabelecem o papel da enolase na patogenicidade de P. brasiliensis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.