Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-02Bitstream added on 2014-06-13T19:03:32Z : No. of bitstreams: 1 pardo_rb_dr_jabo.pdf: 1134204 bytes, checksum: f5af7219cd5d0c42c86945ad29a46afe (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os exames de palpação, inspeção e teste da caneca de fundo escuro, bem como o California Mastitis Test (CMT) foram realizados em 735 quartos mamários de búfalas leiteiras pesquisa de alterações clínicas e subclínicas nos quartos e em suas respectivas secreções. Independentemente dos resultados encontrados, foram coletadas amostras de leite para análises microbiológicas e de contagem de células somáticas (CCS). O isolamento microbiológico foi realizado em ágar sangue de ovino 5% e em ágar MacConkey, com 72 horas de incubação em aerobiose a 37oC. Foram procedidas, a cada 24 horas, leitura e identificação dos isolamentos. A ocorrência de quadros de mastite clínica foi representada por um único caso (0,14%) entre os 735 quartos mamários analisados, ocorrendo na fase inicial da lactação e envolvendo microrganismos de origem ambiental (Morganella morganii, Enterobacter aerogenes). Foram considerados quadros de mastite subclínica aqueles com resultados positivos ao CMT acompanhados de exame microbiológico positivo. A freqüência observada de quadros de mastite subclínica entre os 734 quartos mamários estudados foi de 20,03%, dos quais isolou-se principalmente microrganismos contagiosos. Os resultados negativos ao CMT predominaram durante todo o estudo (69,07%), independente da fase de lactação ou estação do ano consideradas, tendo sido observados resultados positivos do exame microbiológico em 57,58% das amostras CMT negativas. Foi elevada a freqüência de microrganismos classificados como contagiosos entre as amostras de leite analisadas, independente da estação do ano e da fase de lactação, entre os quais prevaleceu o Corynebacterium spp. (47,67%), entre os 579 microrganismos pertencentes a 19 gêneros bacterianos crescidos em cultura pura ou em associação. Considerando-se a falta de homogeneidade entre as variâncias, as contagens de células... / A total of 735 mammary quarters from buffalo cows were submitted to inspection, palpation, strip cup test and California Mastitis Test (CMT) in order to diagnose clinical and subclinical mastitis. Independent of the observed results, milk samples were collected from each mammary quarter to microbiological exams and automatic somatic cell counts (SSC). Milk samples were inoculated in 5% ovine blood agar and MacConkey agar and incubated for 72 hours under 37oC and aerobic condition. Growth observations and identifications were performed every 24 hours. One (0,14%) out of 735 mammary quarters studied presented clinical mastitis. It occurred in first stage of lactation (0 to 60th day post calving) and environmental microorganisms were isolated (Morganella morganii, Enterobacter aerogenes). Mammary quarters presenting positive results to CMT and microbiological exams were considered as subclinical mastitis cases and these represented 20,03% among 734 studied samples. CMT negative results were the most frequent observed during the study (69,07%), independent of lactation stage or season of the year considered. Among these CMT negative milk samples, 57,58% were positive in microbiological exams. There was a high occurrence of contagious microorganisms among the 579 identified bacteria from 19 different genus, isolated in pure or in association. Corynebacterium spp. was the most prevalent (47,67%), in every lactation stage or season of the year. Considering the absence of a normal distribution, somatic cell counts were submitted to a logarithmic transformation, log2(CCS/100)+3, originating the transformed somatic cell count (TSCC). There were statistically significant differences between TCCS means from milk samples with positive (2,23) and negative (1,71) results to CMT. Such differences were also observed in milk... (Complete abstract click electronic access below)

Este estudo objetivou avaliar a: a) eficiência da antibioticoterapia associada à vacinação, de infecções intramamárias (IIM) causadas por Staphylococcus aureus (S. aureus) durante a lactação e secagem; b) variabilidade genética de S. aureus de acordo com a resposta ao tratamento, antibiograma e técnica de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP). Para a avaliação da eficiência da terapia durante a lactação, foram selecionadas 117 vacas com mastite subclínica causada por S. aureus, a partir de 5 rebanhos leiteiros, as quais foram distribuídas aleatoriamente em três tratamentos: a) controle (sem tratamento), b) antibioticoterapia intramamária + injetável, c) antibioticoterapia intramamária + injetável + vacinação contra S. aureus. Para avaliar a eficiência da antibioticoterapia associada à vacinação contra S. aureus na secagem, foram selecionadas 136 vacas com mastite subclínica causada por S. aureus, as quais foram distribuídas aleatoriamnte em quatro tratamentos: a) antibioticoterapia intramamária, b) antibioticoterapia intramamária + injetável, c) antibioticoterapia intramamária + vacina, d) antibioticoterapia intramamária + injetável + vacina. Para os protocolos de tratamento (lactação e secagem), foi utilizada a vacina antimastítica TopVac (Hipra, Espanha). O antibiótico injetável foi a enrofloxacina (Kinetomax®, Bayer, Brasil), dose única (7,5 mg/kg). A antibioticoterapia intramamária durante a lactação foi realizada com ampicilina 75 mg + cloxacilina 250 mg (Bovigam L, Bayer, Irlanda do Norte), e na secagem, com ampicilina 200 mg + cloxacilina 500 mg (Bovigam ®VS, Bayer, Irlanda do Norte). Um total de 117 isolados de S. aureus foram submetidos à técnica de AFLP. A taxa de cura dos quartos tratados com antibioticoterapia, durante a lactação e na secagem, foi de 80,5% (n = 82) e 91,5% (n = 106), respectivamente. A vacinação contra S. aureus não aumentou a taxa de cura do tratamento durante a lactação, porém reduziu a CCS das vacas vacinada em comparação com as vacas do tratamento controle. No tratamento durante a lactação, primíparas e vacas com apenas um quarto infectado apresentaram maior taxa de cura (79 e 70%, respectivamente) do que pluríparas e vacas com dois ou mais quartos infectados (11 e 17%, respectivamente), respectivamente. A resistência à penicilina não afetou a taxa de cura dos isolados de S. aureus. A probabilidade de um isolado não adaptado à glândula mamária ser multirresistente e resistente à oxacilina foi maior do que a de um isolado adaptado, porém a taxa de cura dos isolados não adaptados foi maior do que a de isolados adaptados. Em conclusão, a antibioticoterapia foi eficiente para tratamento de mastite subclínica causada por S. aureus durante a lactação e secagem, e o resultado de antibiograma foi associado à classificação dos isolados em adaptados e não adaptados, porém não foi associado à resposta a antibioticoterapia / The objectives of this study were to evaluate: a) treatment effectiveness, using antibiotics and vaccination, in cows with intramammary infections caused by S. aureus during lactation and dry period; b) the genetic variability of S. aureus strains according to treatment responses, antibiogram and the AFLP technique. To evaluate the effectiveness of the lactation therapy, 117 icows with S. aureus subclinical mastitis, from 5 herds, were randomly distributed into 3 treatments: a) control; b) Intramammary + Injectable; c) Intramammary + injectable + Vaccine. To evaluate the effectiveness of the dry off therapy, 136 cows with S. aureus subclinical mastitis were randomly distributed into 4 treatments: a) Intramammary; b) Intramammary + Injectable (INT + INJ); c) Intramammary + Vaccine (INT + VAC); d) Intramammary + Injectable + Vaccine (INT + INJ + VAC). For both therapies (lactation and dry off), the antimastitis vaccine was the TopVac (Hipra, Spain). The injetable antibiotic was enrofloxacin (Kinetomax®, Bayer S. A., Brasil) single dose (7,5 mg/kg). The intramammary therapy was, during lactation, with ampicillin 75 mg + cloxacilin 200 mg (Bovigam L, Bayer, North Ireland) and at dry off with ampicillin 250 mg + cloxacilin 500 mg (Bovigam ®VS, Bayer, North Ireland). S. aureus isolates (117) were submitted to the AFLP technique. The cure rate of quarters treated with antibiotics during lactation and dry period was 80,5% (n = 82) e 91,5% (n = 106), respectively. Vaccination against S. aureus didn't raise the cure rate during lactation, but lowered the SCC of vaccinated cows compared to control cows. In the lactation therapy, primiparous and cows with one infected quarter had higher cure rates (79 and 70%, respectively) than pluriparous and cows with more than one infected quarter (11 and 17%, respectively), respectively. Resistence to penicillin did not affect S. aureus isolates cure rate. The probability of a non adapted S. aureus isolate to be multiresistant and resistant to oxacilin was higher than an adapted isolate, but cure rates of non adapted isolates was higher than adapted isolates. In conclusion, antibiotic therapy was efficient to treat S. aureus subclinical mastitis during lactation and dry period, and the antibiogram result was associated with the isolates classification in adapted and non adapted, but was not associated with the response to therapy

No universo da pecuária leiteira, a mastite representa um importante desafio, sendo responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com redução na produção de leite. O gênero Staphylococcus assume elevada importância como agente etiológico das mastites devido à sua ampla distribuição e freqüência de ocorrência. Foram coletadas amostras de leite de fêmeas bovinas com mastite subclínica para exames microbiológicos e contagem de células somáticas (CCS). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, as amostras positivas foram submetidas a análises das medianas das CCS, testes de susceptibilidade \"in vitro\" frente a diferentes antimicrobianos, assim como pesquisa de genes codificadores das adesinas - genes que codificam para proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebp), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (fnbA), proteína B ligadora de fibronectina (fnbB) e proteína associada à formação de biofilme (bap), por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com os achados do presente estudo, dentre as bactérias do gênero Staphylococcus isoladas, os S. aureus foram verificados com maior freqüência, seguido por Staphylococcus coagulase-negativos - S. intermedius, S. chromogens e S. warneri. Com respeito às medianas das CCS, o gênero Streptococcus spp. apresentou o maior valor. O perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos testados foi semelhante entre as espécies de Staphylococcus coagulase-positivos e negativos, sendo os antimicrobianos cefalexina, cefalotina e ceftiofur os que apresentaram maior frequência de sensibilidade, e penicilina, amoxicilina e ampicilina os que apresentaram maior resistência. Com exceção do (fnbA), todos os outros fatores de virulência estudados foram detectados, sendo os genes eno, fib e a associação dos genes \"eno/fib/bap\" os mais freqüentemente detectados. Nas amostras coletadas dos tanques de refrigeração não foram detectadas todas as espécies de Staphylococcus spp. isoladas dos quartos mamários. Tais informações acerca do assunto permitem o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de tratamento e controle desta enfermidade, possibilitando o aumento da produtividade leiteira. / In the world of dairy cattle, mastitis is a major challenge, accounting for economic losses related mainly to reduction in milk production. The genus Staphylococcus assumes greater importance as a etiologic agent of mastitis due to its wide distribution and frequency of occurrence. Milk samples were collected from cows with subclinical mastitis to microbiological examinations and somatic cell count (SCC). After isolation and identification of microorganisms, positive samples were analyzed for the medians of SCC, tested for susceptibility \"in vitro\" against different antimicrobials and polymerase chain reaction will be used to search for genes encoding adhesins - genes that code for collagen-binding protein (cna), lamininbinding protein (eno), elastin-binding protein (ebp), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA), fibronectin-binding protein B (fnbB) and protein associated with biofilm formation (bap). According to the findings of this study, among the bacteria of the genus Staphylococcus isolated, S. aureus were found most frequently, followed by coagulase-negative Staphylococcus - S. intermedius, S. chromogens and S. warneri. With respect to the medians of CCS, the genus Streptococcus spp. showed the highest. The profile of sensitivity and resistance to antimicrobials was similar among species of coagulase-positive and negative Staphylococcus, and antimicrobial cephalexin, cephalothin, and ceftiofur showed higher frequency sensitivity. Penicillin, amoxicillin and ampicillin showed the highest resistance. With the exception of (fnbA), all other virulence factors were detected, with genes eno, fib and the association of genes \"eno/fib/bap\" the most frequently detected. The samples collected from the cooling tanks were not detected all species of Staphylococcus spp. that were isolated from the mammary glands. Such information on the subject allow the development of more efficient strategies for treatment and control of this disease, allowing for increased milk production.

O uso de antibióticos para tratamento da mastite bovina subclínica durante a lactação apresenta restrições econômicas e a administração indiscriminada e inadequada destes medicamentos os torna potencialmente tóxicos aos animais e aos consumidores finais dos produtos lácteos. A utilização de medicamentos homeopáticos oferece menor custo, facilidade de administração, não há risco de resistência microbiana e não é necessário o descarte do leite dos animais em tratamento. Além disso, a homeopatia é reconhecida no Brasil como especialidade médica veterinária e aceita para uso no sistema de produção animal orgânico. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia de dois protocolos homeopáticos para tratamento da mastite bovina subclínica durante a lactação. O experimento foi realizado no período de seis meses e dividido em duas etapas. Na Etapa I, um grupo foi medicado com Sulphur 30CH, enquanto que o outro recebeu placebo. Na Etapa II, um grupo foi medicado com Calcarea carbonica 30CH e o outro grupo recebeu placebo. Os medicamentos foram administrados a cada trinta dias na Etapa I e a cada quinze dias na Etapa II. Em cada etapa foram coletadas amostras de leite antes, durante e após o tratamento. Para avaliar a eficácia dos protocolos, durante o experimento foram analisadas 138 amostras de leite na Etapa I e 72 amostras na Etapa II, realizando-se prova de Tamis, California Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas (CCS), quantificação de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) por microscopia óptica, exame microbiológico e mensuração da produção leiteira. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Graphpad Instat 1990-93. Os protocolos homeopáticos testados não diminuíram a celularidade do leite, pois não houve diferenças significativas nos resultados do CMT e da CCS no decorrer do experimento. Também não foi constatada nenhuma alteração significante na produção láctea. O microrganismo isolado com maior frequência no rebanho estudado foi o Corynebacterium bovis. Porém, não houve diferenças significativas em relação à frequência de isolamento deste microrganismo ao longo dos tratamentos, indicando a sua permanência nas glândulas mamárias. Além disso, observou-se durante todo o experimento o predomínio de células PMN em relação às MN. Sugere-se o estudo de novos protocolos homeopáticos com outros medicamentos, potência e frequência de administração, a fim de buscar alternativas para o tratamento de vacas com mastite subclínica / The use of antibiotics for treatment of bovine subclinical mastitis during lactation presents economic restrictions and the indiscriminate and inappropriate administration of these drugs makes them potentially toxic to animals and consumers of dairy products. The use of homeopathic medicine offers lower cost, ease of administration, no risk of microbial resistance and is not necessary to discard milk from animals under treatment. Furthermore, homeopathy is recognized as a medical specialty in Brazil and support for veterinary use in organic livestock production system. Therefore, this study aimed to evaluate the effectiveness of two protocols for homeopathic treatment of bovine subclinical mastitis during lactation. The experiment was performed between six months and divided into two stages. In Phase I, one group was treated with Sulphur 30CH, while the other received placebo. In Phase II, one group was treated with Calcarea carbonica 30CH and the other group received placebo. The drugs were administered every thirty days in the Phase I and every fifteen days in the Phase II. At each step the milk samples were collected before, during and after treatment. To evaluate the effectiveness of the protocols during the experiment were analyzed 138 samples of milk at Phase I and 72 samples at Phase II, performing proof Tamis, California Mastitis Test (CMT), somatic cell count (SCC), quantification of polymorphonuclear (PMN) and mononuclear (MN) by optical microscopy, microbiological examination and measurement of milk production. Statistical analysis was performed using the software Graphpad Instat 1990-93. The homeopathic protocols tested not diminished cellularity of milk because there were no significant differences in the results of CMT and SCC during the experiment. Nor was it found no significant change in milk production. The organism isolated most frequently in the herd studied was Corynebacterium bovis. However, no significant differences were observed in the frequency of isolation of this microorganism during the treatments, indicating his permanence in the mammary glands. Furthermore, it was observed during the experiment a predominance of PMN cells compared to MN. It is suggested the study of new protocols with other homeopathic medicines, potency and frequency of administration, to find alternatives for the treatment of cows with subclinical mastitis

No universo da pecuária leiteira, a mastite representa um importante desafio, sendo responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com redução na produção de leite. O gênero Staphylococcus assume elevada importância como agente etiológico das mastites devido à sua ampla distribuição e freqüência de ocorrência. Foram coletadas amostras de leite de fêmeas bovinas com mastite subclínica para exames microbiológicos e contagem de células somáticas (CCS). Após o isolamento e identificação dos micro-organismos, as amostras positivas foram submetidas a análises das medianas das CCS, testes de susceptibilidade \"in vitro\" frente a diferentes antimicrobianos, assim como pesquisa de genes codificadores das adesinas - genes que codificam para proteína ligadora de colágeno (cna), proteína ligadora de laminina (eno), proteína ligadora de elastina (ebp), proteína ligadora de fibrinogênio (fib), proteína A ligadora de fibronectina (fnbA), proteína B ligadora de fibronectina (fnbB) e proteína associada à formação de biofilme (bap), por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). De acordo com os achados do presente estudo, dentre as bactérias do gênero Staphylococcus isoladas, os S. aureus foram verificados com maior freqüência, seguido por Staphylococcus coagulase-negativos - S. intermedius, S. chromogens e S. warneri. Com respeito às medianas das CCS, o gênero Streptococcus spp. apresentou o maior valor. O perfil de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos testados foi semelhante entre as espécies de Staphylococcus coagulase-positivos e negativos, sendo os antimicrobianos cefalexina, cefalotina e ceftiofur os que apresentaram maior frequência de sensibilidade, e penicilina, amoxicilina e ampicilina os que apresentaram maior resistência. Com exceção do (fnbA), todos os outros fatores de virulência estudados foram detectados, sendo os genes eno, fib e a associação dos genes \"eno/fib/bap\" os mais freqüentemente detectados. Nas amostras coletadas dos tanques de refrigeração não foram detectadas todas as espécies de Staphylococcus spp. isoladas dos quartos mamários. Tais informações acerca do assunto permitem o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de tratamento e controle desta enfermidade, possibilitando o aumento da produtividade leiteira. / In the world of dairy cattle, mastitis is a major challenge, accounting for economic losses related mainly to reduction in milk production. The genus Staphylococcus assumes greater importance as a etiologic agent of mastitis due to its wide distribution and frequency of occurrence. Milk samples were collected from cows with subclinical mastitis to microbiological examinations and somatic cell count (SCC). After isolation and identification of microorganisms, positive samples were analyzed for the medians of SCC, tested for susceptibility \"in vitro\" against different antimicrobials and polymerase chain reaction will be used to search for genes encoding adhesins - genes that code for collagen-binding protein (cna), lamininbinding protein (eno), elastin-binding protein (ebp), fibrinogen-binding protein (fib), fibronectin-binding protein A (fnbA), fibronectin-binding protein B (fnbB) and protein associated with biofilm formation (bap). According to the findings of this study, among the bacteria of the genus Staphylococcus isolated, S. aureus were found most frequently, followed by coagulase-negative Staphylococcus - S. intermedius, S. chromogens and S. warneri. With respect to the medians of CCS, the genus Streptococcus spp. showed the highest. The profile of sensitivity and resistance to antimicrobials was similar among species of coagulase-positive and negative Staphylococcus, and antimicrobial cephalexin, cephalothin, and ceftiofur showed higher frequency sensitivity. Penicillin, amoxicillin and ampicillin showed the highest resistance. With the exception of (fnbA), all other virulence factors were detected, with genes eno, fib and the association of genes \"eno/fib/bap\" the most frequently detected. The samples collected from the cooling tanks were not detected all species of Staphylococcus spp. that were isolated from the mammary glands. Such information on the subject allow the development of more efficient strategies for treatment and control of this disease, allowing for increased milk production.

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. / The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.

Submitted by LUCAS EDUARDO PILON null (lucaseduardopilon@yahoo.com.br) on 2016-03-07T12:00:11Z No. of bitstreams: 1 Tese Lucas Eduardo Pilon.pdf: 1670960 bytes, checksum: 4da72578d702faee29a2735a07314cd0 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-07T13:38:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pilon_le_dr_jabo.pdf: 1670960 bytes, checksum: 4da72578d702faee29a2735a07314cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-07T13:38:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pilon_le_dr_jabo.pdf: 1670960 bytes, checksum: 4da72578d702faee29a2735a07314cd0 (MD5) Previous issue date: 2016-02-05 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A mastite em ovelhas de dupla aptidão é reconhecida por afetar a qualidade do leite. Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são os principais micro-organismos responsáveis pela doença, e o tratamento ao final da lactação, pode contribuir para a cura e prevenção de casos subclínicos na lactação consecutiva. Entretanto, fatores de virulência e mecanismos de resistência apresentados por SCN podem reduzir as taxas de cura. Os objetivos deste trabalho foram identificar no leite de ovelhas tratadas e não tratadas à secagem com antimicrobianos, as espécies de SCN antes e após o tratamento e identificar nesses micro-organismos a presença dos genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed e tsst-1, determinar o perfil clonal das principais espécies identificadas e relacionar os casos de cura após o tratamento com a presença/ausência dos respectivos genes. Sessenta ovelhas foram divididas em três grupos experimentais: G1, controle, metades mamárias que não receberam antimicrobiano; G2, metades mamárias em que foram administrados 10 mL de cloxacilina-benzatina 100 mg via intramamária / estrutura convencional; G3, metades mamárias em que foram administrados 86 mL de cloxacilina-benzatina 50 mg via intramamária / estrutura nanoencapsulada. As amostras de leite foram coletadas à secagem e aos 15 e 30 dias pós-parto da lactação seguinte. As análises para identificação das espécies de SCN foram realizadas por meio de testes bioquímicos e Internal Transcribe Spacer (ITS-PCR), e a pesquisa dos genes responsáveis pelos fatores de virulência e pela resistência à oxacilina foram realizados por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Dentre as espécies identificadas S. warneri prevaleceram nos três grupos experimentais. Nenhuma amostra foi positiva para o gene mecA. O único gene relacionado com a produção de enterotoxinas encontrado foi o sec. Dentre os genes relacionados com a produção de biofilme, icaD foi o único identificado nos três grupos experimentais. Staphylococcus warneri, S. simulans e S. epidermidis apresentaram clones na mesma metade mamária no pré e pós-parto das ovelhas. A cloxacilina benzatina nanoparticulada 50mg / 86 mL foi eficiente para reduzir a mastite subclínica no pós-parto de ovelhas (P= 0,0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis e S. xylosus foram as espécies de maior ocorrência. Os genes icaA, icaC, icaD e bap foram encontrados no momento da desmama e no pós-parto, os genes sec e icaD estão associados à ausência de cura da mastite subclínica no pós-parto. Ovelhas em que foram isolados SCN portadores de genes responsáveis pela formação de biofilme não apresentaram resultados satisfatórios quando submetidas a esquemas de controle e ao tratamento da mastite subclínica. Os genes sec e icaD, estão associadas à ausência de cura microbiológica da mastite subclínica no pós-parto. Staphylococcus epidermidis e S. xylosus portador do gene bap estão associados à reinfecção. / Mastitis in dual-purpose sheep is recognized to affect their milk quality. Coagulase-negative Staphylococcus (CNS) is the main microorganism responsible for this disease and treatment at the end of lactation may contribute towards curing it and preventing subclinical cases during the consecutive lactation. However, virulence factors and resistance mechanisms presented by CNS may reduce the cure rates. The aims of this study were to identify CNS species in sheep’s milk with and without treatment with antimicrobials at the time of drying off and, in these microorganisms, to identify presence of the genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed and tsst-1, determine clonal profile of the main species identified and correlate the cases of cure after treatment with the presence or absence of the respective genes. Sixty sheep were divided into three experimental groups: G1 (control), mammary glands that did not receive antimicrobials; G2, mammary glands to which 10 mL of cloxacillin-benzathine (100 mg) was administered via the intramammary route in a conventional structure; and G3, mammary glands to which 86 mL of cloxacillin-benzathine (50 mg) was administered via the intramammary route in a nanoencapsulated structure. Milk samples were collected at the time of drying off and 15 and 30 days after lambing in the next lactation. The analyses to identify the CNS species were performed by means of biochemical tests and internal transcribe spacer polymerase chain reaction (ITS-PCR), and the genes responsible for the virulence factors and resistance to oxacillin were investigated by means of the PCR technique. Among the species identified, Staphylococcus warneri was most prevalent in the three experimental groups. None of the samples were positive for the gene mecA. The only gene relating to production of enterotoxins that was found was sec. Among the genes relating to biofilm production, icaD was the only one identified in the three experimental groups. Staphylococcus warneri, S. simulans and S. epidermidis presented clones in the same mammary gland before and after lambing. The dose of 86 mL of nanoparticulate cloxacillin-benzathine (50 mg) was efficient for reducing subclinical mastitis after lambing (P = 0.0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis and S. xylosus were the species that occurred most frequently. The genes icaA, icaC, icaD and bap were found at the time of weaning and in the postpartum period. The genes sec and icaD were correlated with absence of cure for subclinical mastitis after lambing. Sheep in which CNS carrying genes responsible for biofilm formation was isolated did not present satisfactory results when they were subjected to regimens for controlling and treating subclinical mastitis. The genes sec and icaD were correlated with absence of microbiological control over subclinical mastitis after lambing. Staphylococcus epidermidis and S. xylosus carrying the gene bap were correlated with reinfection. / FAPESP: 2012/23044-0

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. / The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. / The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.

O uso de antibióticos para tratamento da mastite bovina subclínica durante a lactação apresenta restrições econômicas e a administração indiscriminada e inadequada destes medicamentos os torna potencialmente tóxicos aos animais e aos consumidores finais dos produtos lácteos. A utilização de medicamentos homeopáticos oferece menor custo, facilidade de administração, não há risco de resistência microbiana e não é necessário o descarte do leite dos animais em tratamento. Além disso, a homeopatia é reconhecida no Brasil como especialidade médica veterinária e aceita para uso no sistema de produção animal orgânico. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia de dois protocolos homeopáticos para tratamento da mastite bovina subclínica durante a lactação. O experimento foi realizado no período de seis meses e dividido em duas etapas. Na Etapa I, um grupo foi medicado com Sulphur 30CH, enquanto que o outro recebeu placebo. Na Etapa II, um grupo foi medicado com Calcarea carbonica 30CH e o outro grupo recebeu placebo. Os medicamentos foram administrados a cada trinta dias na Etapa I e a cada quinze dias na Etapa II. Em cada etapa foram coletadas amostras de leite antes, durante e após o tratamento. Para avaliar a eficácia dos protocolos, durante o experimento foram analisadas 138 amostras de leite na Etapa I e 72 amostras na Etapa II, realizando-se prova de Tamis, California Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas (CCS), quantificação de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) por microscopia óptica, exame microbiológico e mensuração da produção leiteira. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Graphpad Instat 1990-93. Os protocolos homeopáticos testados não diminuíram a celularidade do leite, pois não houve diferenças significativas nos resultados do CMT e da CCS no decorrer do experimento. Também não foi constatada nenhuma alteração significante na produção láctea. O microrganismo isolado com maior frequência no rebanho estudado foi o Corynebacterium bovis. Porém, não houve diferenças significativas em relação à frequência de isolamento deste microrganismo ao longo dos tratamentos, indicando a sua permanência nas glândulas mamárias. Além disso, observou-se durante todo o experimento o predomínio de células PMN em relação às MN. Sugere-se o estudo de novos protocolos homeopáticos com outros medicamentos, potência e frequência de administração, a fim de buscar alternativas para o tratamento de vacas com mastite subclínica / The use of antibiotics for treatment of bovine subclinical mastitis during lactation presents economic restrictions and the indiscriminate and inappropriate administration of these drugs makes them potentially toxic to animals and consumers of dairy products. The use of homeopathic medicine offers lower cost, ease of administration, no risk of microbial resistance and is not necessary to discard milk from animals under treatment. Furthermore, homeopathy is recognized as a medical specialty in Brazil and support for veterinary use in organic livestock production system. Therefore, this study aimed to evaluate the effectiveness of two protocols for homeopathic treatment of bovine subclinical mastitis during lactation. The experiment was performed between six months and divided into two stages. In Phase I, one group was treated with Sulphur 30CH, while the other received placebo. In Phase II, one group was treated with Calcarea carbonica 30CH and the other group received placebo. The drugs were administered every thirty days in the Phase I and every fifteen days in the Phase II. At each step the milk samples were collected before, during and after treatment. To evaluate the effectiveness of the protocols during the experiment were analyzed 138 samples of milk at Phase I and 72 samples at Phase II, performing proof Tamis, California Mastitis Test (CMT), somatic cell count (SCC), quantification of polymorphonuclear (PMN) and mononuclear (MN) by optical microscopy, microbiological examination and measurement of milk production. Statistical analysis was performed using the software Graphpad Instat 1990-93. The homeopathic protocols tested not diminished cellularity of milk because there were no significant differences in the results of CMT and SCC during the experiment. Nor was it found no significant change in milk production. The organism isolated most frequently in the herd studied was Corynebacterium bovis. However, no significant differences were observed in the frequency of isolation of this microorganism during the treatments, indicating his permanence in the mammary glands. Furthermore, it was observed during the experiment a predominance of PMN cells compared to MN. It is suggested the study of new protocols with other homeopathic medicines, potency and frequency of administration, to find alternatives for the treatment of cows with subclinical mastitis