Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11634_Dissertação Mariana Teixeira Gonçalves.pdf: 2671707 bytes, checksum: 452907fd6c9a4b2755e0cb8fc98fb7ea (MD5) Previous issue date: 2017-09-27 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente causador de diarréia aguda e persistente em todo o mundo. A formação de biofilme, um aspecto notável da sua patogenicidade, está relacionada à persistência da infecção e requer tratamento antimicrobiano, sendo sugerido o uso de ampicilina, quinolona, sulfametoxazol/trimetoprim e tetraciclina. Como as técnicas habituais de determinação de suscetibilidade não refletem a atividade em biofilme tivemos como objetivo determinar a concentração mínima inibitória de biofilme (MBIC) de nove antimicrobianos de oito classes, e determinar a concentração mínima de erradicação do biofilme (MBEC), por meio do sistema Calgary (peg-lid), para amostras clínicas de EAEC, para as cepas protótipos EAEC 042 e EAEC 17-2 e para cepa de referência ATCC 25922. Concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada para 35 amostras por diluição em ágar e foram selecionadas 20 sensíveis aos antimicrobianos ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cloranfenicol, ciprofloxacina, tetraciclina e tobramicina e 19 a sulfametoxazol/trimetoprim para determinação da MBIC. Biofilme foi formado em Meio Mínimo de Eagle Modificado por Dulbecco com glicose 0,4% e foram determinados o tempo de maturação do biofilme e a intensidade de formação, tanto no poço da microplaca quanto no peg-lid. A maturação do biofilme foi atingida com 24 h; oito e 12 amostras foram classificadas como fortes e fracas formadoras de biofilme, respectivamente. Biofilme de 24 h foi submetido a diluições dobradas dos antimicrobianos em caldo Mueller-Hinton ajustado com cátion e densidade óptica a 650 nm (DO650) foi medida após a recuperação do biofilme por ultrasom, antes e após a incubação a 37ºC por 6 horas. A MBIC revelou que os biofilmes foram: (i) 100% (20/20) resistentes à tetraciclina, cloranfenicol e sulfametoxazol/trimetoprim e 90% (18/20) à ampicilina; (ii) 90% (18/20) com resistência intermediária à ceftriaxona e cefotaxima, (iii) 95% (19/20), sensíveis à ciprofloxacina, 80% (16/20) à cefoxitina e 75% (15/20) à tobramicina. Biofilme aumentou a concentração inibitória dos antimicrobianos em 2 vezes a até 4.266,7 vezes a CMI e amostras fortes formadoras aumentaram a MBIC de ampicilina, ceftriaxona e tobramicina mais do que as fracas formadoras (p<0,05). A MBEC foi sempre superior à MBIC e à última concentração testada, com exceção de cefoxitina e cefotaxima para uma amostra. Tempo de maturação de biofilme de 48h, e 72h não interferiu na MBIC. Em conclusão, a ciprofloxacina apresentou ótima atividade para biofilme de EAEC, seguida por cefoxitina e tobramicina e que não devem ser preconizados os antimicrobianos que se mostraram ineficazes como ampicilina, sulfametoxazol/trimetoprim e tetraciclinas para tratamento de infecção por EAEC.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) à um patÃtipo de E. coli que tem sido cada vez mais identificado como agente etiolÃgico das doenÃas diarrÃicas. Esse trabalho teve como objetivos determinar a prevalÃncia de EAEC e investigar a importÃncia de alguns genes associados à virulÃncia no grau de severidade das doenÃas diarrÃicas causadas pelo microorganismo, alÃm de avaliar o impacto dessas infecÃÃes na inflamaÃÃo intestinal e no estado nutricional de crianÃas carentes de Fortaleza, CearÃ. CrianÃas na faixa etÃria entre 2 e 36 meses, com histÃrico ou nÃo de diarrÃia nos Ãltimos 14 dias, tiveram suas medidas antropomÃtricas avaliadas e suas amostras fecais coletadas. O diagnÃstico de EAEC foi realizado por reaÃÃo de polimerase em cadeia (PCR) dos genes aaiC (cromossomal) e aatA (plasmidial). Amostras positivas foram pesquisadas quanto à presenÃa dos genes de virulÃncia aggR (regulador transcricional), aap (dispersina), pic (enterotoxina), pet (enterotoxina) e astA (enterotoxina). A sequÃncia nucleotÃdica do gene aggR foi analisada atravÃs de seqÃenciamento. AlÃquotas fecais foram submetidas à quantificaÃÃo de lactoferrina (LFF) e citocinas (IL-4, IL-10, TNF-&#945; e IFN-&#947;) atravÃs de reaÃÃo imunoenzimÃtica (ELISA). Esse estudo analisou 83 crianÃas com diarrÃia (casos) e 83 crianÃas sem diarrÃia (controles). EAEC foi encontrada na mesma proporÃÃo entre ambos os grupos (41,0%). CrianÃas com diarrÃia apresentaram reduÃÃo significativa na espessura da prega cutÃnea, Ãndice de massa corporal e escores-z peso-por-idade (WAZ) e peso-por-altura (WHZ), mas a presenÃa da bactÃria nÃo foi associada com alteraÃÃes nos Ãndices antropomÃtricos analisados. Entre as amostras positivas para EAEC, nÃo houve diferenÃa quanto à presenÃa isolada dos fatores de virulÃncia pesquisados nas crianÃas que desenvolveram ou nÃo diarrÃia. Avaliando as freqÃÃncias desses genes em combinaÃÃo, cepas de EAEC expressando os genes aggR, aap, pic, pet e astA foram isoladas em freqÃÃncia superior significativa de crianÃas doentes quando comparadas com cepas de EAEC expressando somente aggR, aap, pic e astA (excluindo o gene pet). A anÃlise da seqÃÃncia codificadora do gene aggR apresentou 27 polimorfismos em um Ãnico nucleotÃdeo (SNPs), distribuÃdos entre cinco amostras caso e trÃs controles. Mais de 80,0% das crianÃas estudadas apresentaram inflamaÃÃo intestinal caracterizada por elevados nÃveis de LFF, independente da presenÃa de diarrÃia e EAEC. Todas as crianÃas com diarrÃia associada com EAEC apresentaram altas concentraÃÃes de LFF. NÃveis basais de citocinas fecais foram observados entre crianÃas de ambos os grupos. A variabilidade na presenÃa dos fatores de virulÃncia pesquisados ratifica a heterogeneidade das cepas de EAEC. A combinaÃÃo de genes codificadores de fatores de virulÃncia mostrou que a presenÃa do pet està associada com a doenÃa causada por EAEC. A infecÃÃo pela bactÃria nÃo causou impacto significativo nos Ãndices antropomÃtricos analisados. As elevadas concentraÃÃes observadas de LFF sugerem a existÃncia de fatores adicionais desencadeadores do processo inflamatÃrio. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is a pathotype of diarrheagenic E. coli, which has increasingly been identified as an etiological agent of diarrheal disease. This purpose of this study is to determine the prevalence of EAEC and examine the importance of some virulence-related genes in the severity of the diarrheal disease caused by this microorganism, and further evaluate the impact of these infections on intestinal inflammation and the nutritional status of poor children from Fortaleza, Ceara. Children aged 2 to 36 months, with and without an occurrence of diarrhea in the previous 14 days, had their anthropometric data evaluated and their stools collected. Diagnosis of EAEC was done by polymerase chain reaction (PCR) of the aaiC (chromosomal) and aatA (plasmidial) genes. Positive samples were further analyzed for the presence of the virulence genes aggR (transcription regulator), aap (dispersin), pic (enterotoxin), pet (enterotoxin) and astA (enterotoxin). The nucleotide sequence of aggR gene was also analyzed by sequencing. Aliquots of stool samples were quantified for lactoferrin (LFF) and cytokines (IL-4, IL-10, TNF-&#945; e IFN-&#947;) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This study analyzed 83 children with diarrhea (cases) and 83 children without diarrhea (controls). EAEC was found in the same proportion in both groups (41.0%). Children with diarrhea presented with significantly reduced skin thickness, body mass index and weight-for-age (WAZ) and weight-for-height (WHZ) z-scores. However, the presence of the bacteria was not associated with changes in the analyzed anthropometric measures. Among the positive samples for EAEC, there was no difference in the presence of the isolated virulence genes in the children with or without diarrhea. Observing the frequencies of these genes in combination, EAEC strains carrying the aggR, aap, pic, pet and astA genes together were isolated in significantly higher frequencies from sick children when compared to EAEC strains expressing only aggR, aap, pic, and astA (excluding pet). Nucleotide sequence analysis of the aggR gene presented 27 polymorphisms of a single nucleotide (SNPs), distributed among five case samples and three control samples. More than 80.0% of studied children had intestinal inflammation characterized by elevated levels of LFF, regardless of the presence of illness and EAEC. All children with diarrhea associated with EAEC presented with high concentrations of LFF. Basal levels of fecal cytokines were observed among children from both groups. Variability in the presence of the evaluated virulence factors confirms the heterogeneity of EAEC strains. The combination of the virulence related genes expressed showed that pet has an association with illness caused by EAEC. The infection by this bacterium did not cause significant impact on the anthropometric index analyzed. The high concentrations of LFF observed suggest that there may be additional factors triggering the inflammatory process.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente, associado à doença diarréica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativo (AA) a superfície de células HEp-2. O fenótipo AA está associado à presença de um plasmídeo de 65 MDa, conhecido como plasmídeo pAA, detectado através de uma sonda genética denominada de CVD432 ou simplesmente AA. Algumas amostras de EAEC, entretanto, apresentam o padrão AA, mas não são portadoras do plasmídeo. No plasmídeo pAA estão presentes vários genes relacionados com as propriedades de virulência, dentre os quais aqueles que codificam as adesinas fimbrias AAF (“Aggregative Adherence Factor” - AAF/I, AAF/II e AAF/III), o regulador de transcrição AggR, a proteína antiagregação (Aap) e as toxinas Pet e EAST1. Outros fatores de virulência de EAEC são codificados por genes cromossômicos, entre eles, a enterotoxina ShET1, o sideróforo Yersiniabactin (irp2), uma ORF críptica (Shf), e uma a-hemolisina. A maioria dos estudos sobre mecanismos de virulência de EAEC compreende amostras que apresentam o padrão AA e que reagem com a sonda AA, ou seja, as amostras de EAEC típicas. Pouco se conhece sobre a presença de potenciais fatores de virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas por nós como EAEC atípicas. Neste estudo analisamos 28 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com diarréia (N = 18) e sem diarréia (N = 10) provenientes de várias cidades brasileiras quanto à presença de seqüências genéticas associadas aos fatores de virulência codificados no plasmídeo pAA e no cromossomo. A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo a média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os marcadores de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly foram encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que de controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado também as seqüências genéticas aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das sequências genéticas astA, shf e irp2.Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF críptica, foram os mais freqüentes (61%) e apresentaram uma freqüência significantemente maior nos casos do que nos controles estudados (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente). A maioria das amostras de EAEC atípicas estudadas reagiu com um dos 175 antissoros utilizados, sendo que alguns desses, como os sorogrupos O42, O126 e O162 foram os mais freqüentes e encontrados apenas nas amostras isoladas de casos. A análise do perfil plasmidial de 12 amostras isoladas de crianças com diarréia mostrou a presença de mais de um plasmídeo de alto peso molecular na maioria das amostras estudadas. Duas amostras, uma contendo apenas um plasmídeo e uma outra sem nenhum plasmídeo foram então selecionadas para caracterização dos genes envolvidos no padrão AA. A amostra RN691-2 portadora de um único plasmídeo e apresentando resistência antimicrobiana múltipla, foi submetida a experimentos de transformação, conjugação e cura, não sendo possível à obtenção de um transformante, transconjugante ou mesmo a amostra isogênica sem o plasmídeo. Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvidos no padrão AA da amostra RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foi construída uma biblioteca genômica e identificado um clone-cosmídeo, designado pVIII-F-1, que apresentou o padrão AA em células HEp-2 de maneira semelhante à amostra selvagem. Para localizar o gene necessário para a adesão, o clone cosmídeo foi submetido a mutagênese com o transposon mini-Tn10 (CmR), sendo identificado o mutante pVIII-F-1 / Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) is emerging as a significant diarrheal pathogen. EAEC is defined by its characteristic “stacked brick” aggregative adherence (AA) pattern of adherence to HEp-2 cells. Most EAEC strains harbor a 60 to 65-MDa virulence plasmid (pAA). A 1-Kb fragment of pAA, referred to as the AA probe or CVD432, has been widely used for epidemiological studies. The pAA also encodes AA fimbrae (AAF) I, II, and III; the transcriptional activator AggR; enteroaggregative heatstable enterotoxin 1 (EAST1); a 104-KDa cytotoxin designated Pet; the cryptic secreted protein Shf; and a novel antiaggregation protein (dispersin) encoded by the aap gene. In addition to the pAA plasmid, some EAEC strains express putative virulence factors that are encoded on the chromosome, including a 116-KDa secreted mucinase (Pic), yersiniabactin (Irp2), and the E. coli a-hemolysin (a-Hly). Shigella enterotoxin 1 (ShET1) is encoded by the antisense strand of the pic gene. Few studies have evaluated the prevalence of EAEC markers in probe-negative strains, reported by us as atypical EAEC. By using atypical EAEC strains isolated in a case-control study, we assessed the prevalence of putative virulence factors, such as AAF/I, AAF/II, AAF/III, AggR, Aap, EAST-1, Pet, Shf, ShET1/Pic, Irp2, and a-Hly, in an attempt to identify their roles as enteric virulence factors. The majority of strains carried two or more of the genes, with two being the modal value; but two strains isolated from a control did not test positive for any of the factors. The AAF, aggR, and aap genes were present in only a minority of strains. The astA, pet, shf, ShET1/pic, irp2 and hly genes were found more frequently in the patients than in the controls. The combination astA and shf was found in 16 strains (57%), followed by 7 strains (25%) possessing the combination astA, shf, and irp2. The common virulence markers found in strains included the Pet, EAST1, Shf, Irp2, ShET1/Pic, and Hly virulence markers. EAST1 and Shf were the most frequently detected markers (61%) in strains and were found to be significantly associated with diarrhea (P = 0,003 and P = 0,020, respectively). The majority (75%) of the EAEC isolates reacted with one of the antisera used. It was interesting that the strains belonging to serogroups O42, O126 and O162 were detected only in children with diarrhea.Plasmid analysis of 12 strains isolated from diarrhea showed that the majority of strains contained large plasmids. Two strains, one carrying only one plasmid (MA691-2) and another one any plasmid (RN153-1), were chosen for genetic studies on the identification of genes responsible for the AA phenotype. Plasmid from MA691-2 strain was transferred to E. coli K12 and no transformant or transconjugant harboring the plasmid or isogenic derivative strain lacking the plasmid was identified. A genomic cosmid library of EAEC RN153-1 was generated in E. coli K12, and the resulting clones were screened for aggregative adherence to HEp-2 cells. One cosmid clone, pVIII-F-1, exhibited the same adherence as the wild-type, albeit to a lesser extent. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pVIII-F-1 responsible for the aggregative phenotype. Plasmid pBSL181 carrying mini-Tn10 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) està entre os mais importantes agentes associados Ãs doenÃas diarreicas persistentes (DP) e mostrou-se prevalente em estudos na populaÃÃo infantil em comunidades carentes da cidade de Fortaleza. A EAEC causa lesÃo e inflamaÃÃo intestinal levando a DP e, quando associada à desnutriÃÃo, pode ocasionar um dÃficit cognitivo e reduÃÃo do crescimento infantil. Este estudo analisou in vitro (IEC-6 e HEp-2), o papel da alanil-glutamina (AG) e do betacaroteno nos mecanismos de proliferaÃÃo, apoptose e necrose e em resposta a lesÃo intestinal induzida por uma cepa EAEC selvagem (LDI001), uma cepa controle EAEC 042 e uma cepa de E. coli HS comensal. A cepa LDI001 foi isolada de uma crianÃa desnutrida. Na viabilidade celular houve uma reduÃÃo significativa (p<0.05) pÃs-infecÃÃo com as EAECs nas concentraÃÃes de 105UFC/mL nos tempos de 12, 24 e 48 horas. Contudo, a cepa comensal apenas alterou no tempo tardio (48h). As cÃlulas lesionadas por EAEC diminuÃram a transcriÃÃo (p<0.05) do mRNA dos genes c-jun e c-fos e, apenas tardiamente (12h), com a cepa comensal. A apoptose celular aumentou (p<0.05) apÃs a infecÃÃo com todas as cepas em 24h. PorÃm, o dano persistiu elevado apenas nas cÃlulas tratadas com as cepas de EAEC. A cepa 042 aumentou as cÃlulas necrÃticas (p<0.05) em todos os tempos, embora a LDI001 causou o dano apenas em 24h.Todas as cÃlulas infectadas sofreram aumento da transcriÃÃo (p<0.05) de caspase 8 em 12h. Houve aumento trascricional (p<0.05) de NF-kB em 12h nas cÃlulas infectadas. Enquanto os nÃveis de transcriÃÃo de IL-8 foram altos imediatamente ao termino da infecÃÃo (0h) e houve reduÃÃo em 12h. A LDI001 causou reduÃÃo da viabilidade celular vinculada à sua aÃÃo apoptÃtica. A EAEC 042 induziu danos tanto pela apoptose como a necrose celular. A cepa comensal mostrou um perfil diferenciado das outras cepas provavelmente por nÃo apresentar genes de virulÃncia. A suplementaÃÃo com AG 1mM foi capaz de aumentar a proliferaÃÃo celular (p<0.05) associado a reduÃÃo da apoptose e necrose (p<0.05) nas cÃlulas pÃs-infectadas nos tempos de 12, 24 e 48h. Contudo, a presenÃa de AG 1mM nas cÃlulas infectadas nÃo alterou os baixos nÃveis transcricionais de c-jun e c-fos promovidos pela infecÃÃo, e nÃo conseguiu bloquear a transcriÃÃo significante (p<0.05) de caspase 8. Os nÃveis de transcriÃÃo de NF-kB ainda permaneceu aumentado (p<0.05) na presenÃa de AG em cÃlulas pÃs-infectadas no tempo de 12h. Percebeu-se a continua reduÃÃo temporal da transcriÃÃo de IL-8 nÃo estava associada ao tratamento das cÃlulas infectadas com AG 1mM. A suplementaÃÃo com AG obteve efeitos positivos na proteÃÃo epitelial contra os danos causados pela infecÃÃo das cepas tanto nos processos proliferativos quanto na inibiÃÃo de morte celular. Contudo, a alanil-glutamina nÃo bloqueou a transcriÃÃo de caspase 8 podendo sua funÃÃo antiapoptÃtica estar relacionada a outra via de aÃÃo no presente modelo em estudo. O tratamento com betacaroteno promoveu a reversÃo do dano na viabilidade celular significativa (p<0.05) apenas em 24h apÃs infecÃÃo. Enquanto a presenÃa do betacaroteno em cÃlulas pÃs-infectadas com EAEC selvagem causou aumento de apoptose e necrose (p<0.05) em 48h. CÃlulas infectadas tratadas com betacaroteno nÃo aumentaram os nÃveis de c-jun e c-fos e tambÃm nÃo conseguiram bloquear a transcriÃÃo de caspase 8 e aumentaram (p<0.05) os nÃveis de caspase 3 no tempo de 12h. O betacaroteno mostrou-se potencialmente lesivo Ãs cÃlulas causando morte celular, provavelmente, relacionado aos seus efeitos prooxidantes. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is among the most important agents associated with persistent diarrhea (DP) and was prevalent in studies in children in poor communities in the city of Fortaleza. EAEC cause intestinal injury and inflammation leading to DP and, when combined with malnutrition, can cause a cognitive deficit and infant growth impairment. The current study examined in vitro (IEC-6 and HEp-2) intestinal pathophysiology of three strains: EAEC wild type, EAEC 042 (positive control) and non-pathogenic E.coli HS as well as the role of alanyl-glutamine (AG) and beta-carotene in the mechanisms of proliferation, apoptosis and necrosis in response to the injury caused by EAEC strains. The wild type strain was isolated from a malnourished child. Intestinal cells viability assay in showed a significant reduction (p<0.05) after post-infection with EAEC strains at concentrations of 105UFC/mL in 12, 24 and 48 hours. However, the E.coli HS only changed the intestinal cell viability after 48 hours. EAEC post-infected intestinal cells presented mRNA transcription decrease (p<0.05) of c-jun and c-fos at the period of zero, 6 and 12 hours after infection was terminated, but E.coli HS showed this decrease only after 12h of infection. Intestinal cell apoptosis increased after infection by all strains 24h of infection. However, the cell damage remained intense in the cells treated only with EAEC strains. EAEC 042 increased cell necrosis (p<0.05) in all evaluated periods, but the wild type strain caused damage with only at the period of 24h. All infected cells had a mRNA transcription increase of caspase 8 gene (p<0.05) in12h. NF-kB mRNA transcription increase (p<0.05) was seen in infected cells only in the period of 12h. While transcription levels of IL-8 were extremely high immediately after the infection was interrupted (0h), that was a drastic reduction at 12h after the end of infection. The wild type strain caused a reduction in cell viability linked apoptosis. However, EAEC 042 induced this decrease as also cellular necrosis. E. coli HS showed a different infection profile probably because its lack of virulence genes. AG 1mM supplementation was able to enhance cell proliferation (p<0.05) associated with apoptosis and necrosis reduction (p<0.05) in post-infected cells at the periods of 12, 24 and 48h. However, the presence of AG 1mM in infected cells did not affect the mRNA transcription low levels of c-jun and c-fos as seen after EAEC infection, and failed to block caspase 8 mRNA transcription increase (p<0.05). The IL-8 mRNA transcription temporal reduction was not associated with AG treatment in post-infected cells. Supplementation with AG had positive effects on epithelial protection against damage caused by both EAEC strains in proliferation assay and inhibition of cell death. However, since caspase 8 mRNA transcription decrease was not observed after AG treatment, AG anti-apoptosis feature could be probably related to another mechanism. Beta-carotene cell damage reversal on cell viability assay was statistical significant (p<0.05) 24 hours after infection was ended. Beta-carotene caused 48h apoptosis and necrosis (p<0.05) in wild type strain post-infected cells. Infected cells treated with beta-carotene could not block c-jun and c-fos mRNA transcription reduction and also failed to inhibit caspase 8 mRNA transcription, but beta-carotene itself increased levels of caspase 3 at the period of 12h after infection. Beta-carotene was shown to be potentially harmful to intestinal cells causing cell death probably related to its pro-oxidant effects.

As serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) constituem uma família de proteases secretadas pelo sistema de secreção do tipo V, cujos genes foram estudados em Escherichia coli intestinal e extra-intestinal. Sat é uma SPATE citotóxica de 107 kDa, cujo gene foi identificado pela primeira vez em UPEC isolada da urina de um paciente com pielonefrite. A maioria dos estudos envolvendo Sat foram realizados em células renais e da bexiga, embora seu gene seja encontrado em DAEC, EAEC e, mais recentemente, em amostras bacterianas isoladas de septicemia neonatal e meningite. Os objetivos deste trabalho foram: i) purificar Sat; ii) determinar a ação da Sat purificada em diferentes tipos celulares e iii) caracterizar o papel de Sat na infecção in vitro por EAEC. Desta foram, a presença de Sat nos sobrenadantes do cultivo das cepas EAEC CV323 e DEC/Sat, isoladas de diarreia, foi confirmada por LC-MS/MS. Sat foi purificada da cultura de DEC/Sat+ e utilizada para a obtenção de anticorpos anti-Sat em coelho. O efeito citotóxico de Sat purificada foi investigado em células derivadas do endotélio (HUVEC) e do sistema urinário (Y1, LLC-PK1 e HEK-293) e gastrointestinal (Caco-2). Os parâmetros citotóxicos analisados foram: o descolamento celular e alterações na morfologia, permeabilidade e metabolismo mitocondrial das células. Para investigar o papel de Sat na infecção por EAEC, células Y-1 foram infectadas com EAEC CV323 e DEC/Sat+ na presença ou ausência de PMSF (inibidor de serino-protease) e anticorpos anti-Sat. Os parâmetros de citotoxicidade analisados nas culturas infectadas foram descolamento celular e alteração na morfologia. Os resultados demonstraram que: i) Sat é secretada por EAEC CV323 e DEC/Sat+ e, em ambas as cepas, há duas mutações em resíduos de aminoácidos que não interferiram na atividade enzimática; ii) as células do endotélio são mais sensíveis à Sat do que as células derivadas do trato urinário, sendo a linhagem gastrointestinal a mais resistente; iii) Sat secretada por EAEC CV323 durante a infecção induziu intenso dano celular, o qual, em presença de anticorpos anti-Sat e PMSF foi reduzido em cerca de 80 a 90%, respectivamente. Este é o primeiro trabalho que demonstra a expressão de Sat pela EAEC e a ação da toxina em células endoteliais sugerindo que o papel de Sat possa ser mais amplo na patogenia do que o proposto até o momento. / The serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs) constitute a family of proteases secreted by the type V secretion system whose genes have been studied in intestinal and extra intestinal Escherichia coli. Sat is a 107 kDa cytotoxic SPATE and its gene was first identified in UPEC isolated from the urine of a patient with pyelonephritis. Most studies involving Sat were performed in renal and bladder cells, although the gene encoding Sat is encountered in other strains of E. coli such as DAEC, EAEC and more recently, in bacterial samples isolated from neonatal septicemia and meningitis. The objectives of this work were: i) purify Sat; ii) to determine the action of Sat in different types of cells and iii) to characterize in vitro the role of Sat in EAEC infection. Accordingly, the presence of Sat in the culture supernatant of EAEC CV323 and DEC/Sat+ derived from diarrhea was confirmed by LCMS/MS. Sat was purified from the culture of DEC/Sat+ and utilized to produce rabbit antibodies anti-Sat. The cytotoxic effect of Sat was investigated in cells derived from the endothelium (HUVEC) and the urinary (Y1, LLC-PK1, HEK-293) and gastrointestinal (Caco-2) systems. The cytotoxic parameters analyzed were cellular detachment and alterations in the morphology, permeability and mitochondrial metabolism of the cells. To investigate the role of Sat in EAEC infection, Y-1 cells were incubated with EAEC CV323 and DEC/Sat+ in the presence or absence of PMSF (a serine protease inhibitor) and rabbit antibodies anti-Sat. The parameters analyzed were cellular detachment and alteration in the morphology of the cells. The results demonstrated that: i) Sat is secreted by EAEC CV323 and DEC/Sat + and in both strains there are two mutations in amino acid residues that did not interfere with enzymatic activity; ii) endothelium cells are more sensitive to the Sat effect than the cells derived from urinary tract system, being the gastrointestinal cell lineage the most resistant one; iii) Sat secreted by EAEC CV323 during infection induced intense cellular damage which in the presence of anti-Sat antibodies and PMSF was reduced in about 80 to 90%, respectively. This is the first work demonstrating the expression of Sat by EAEC and the action of the toxin on endothelial cells suggesting that the role of Sat may be broader in pathogenesis than has been proposed so far.

Orientador: Rodrigo Tavanelli Hernandes / Resumo: A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um importante agente causador de diarreia aguda e persistente em crianças e adultos em todo o mundo. EAEC é definida como isolados de E. coli que produzem o padrão de aderência agregativa (AA) em células epiteliais (HeLa e/ou HEp-2) cultivadas in vitro. O patotipo EAEC pode ser dividido em típico e atípico com base na presença do gene aggR, que codifica um ativador transcricional, presente apenas no primeiro grupo. O objetivo deste estudo foi caracterizar uma coleção de isolados de EAEC obtidos de pacientes com diarreia durante um período de 7 anos de vigilância epidemiológica (2010-2016). Um total de 220 isolados de EAEC (194 típicas e 26 atípicas) foi classificado nos distintos grupos filogenéticos de E. coli, e caracterizados quanto aos sorotipos (O:H), padrão de aderência produzidos em células HeLa, sensibilidade aos antimicrobianos, e a presença de 25 genes responsáveis por codificarem fatores de virulência no patotipo EAEC. A maioria dos isolados de EAEC foi classificada nos grupos filogenéticos A (44,1%; 97/220) e B1 (21,4%; 47/220). Em relação ao padrão de aderência, observamos que 92,7% (204/220) produziram o padrão AA. Além disso, foram identificados nove isolados (4,1%; 9/220) que produziram a aderência em cadeia (CLA), dos quais seis produziram concomitantemente o padrão AA, além de isolados de EAEC que produzem um padrão de aderência indefinido (1,4%; 3/220) e isolados não aderentes (3,6%; 8/220). Foi identificado some... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an important agent that causes acute and persistent diarrhea in children and adults worldwide. EAEC is defined as E. coli isolates that produce the aggregative adherence pattern (AA) on epithelial cells (HeLa and/or HEp-2) cultured in vitro. The EAEC pathotype can be divided in typical and atypical based on the presence of the aggR gene, which encodes a transcriptional activator, in the former group. The aim of this study was to characterize a collection of EAEC isolates obtained from diarrheal patients over a 7-year period of surveillance (2010-2016). A total of 220 EAEC isolates (194 typical and 26 atypical) were evaluated regarding the phylogenetic classification, serotypes, adherence pattern produced on HeLa cells, susceptibility to antimicrobial drugs and the presence of 25 virulence factor-encoding genes. The majority of the EAEC isolates were assigned to phylogroups A (44.1%; 97/220) and B1 (21.4%; 47/220). Regarding the adherence pattern, was observed that 92.7% (204/220) produced AA. Moreover, we identified nine isolates (4.1%; 9/220) that produced the chain-like adherence (CLA), with six of them producing concomitantly the AA pattern, besides EAEC isolates producing an undefined adherence (1.4%; 3/220) and isolates non-adherent (3.6%; 8/220). Only 0.9% (2/220) of the EAEC isolates studied presented the multidrug resistance phenotype. The genes encoding for the major pilin subunit of all five previously described aggregati... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 &#181;L do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 &#181;l of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 &#181;L do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 &#181;l of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.