Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-07T13:37:49Z No. of bitstreams: 4 Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 01.pdf: 17508857 bytes, checksum: 1d04cb16c6e33e54fe0304cecb5e491b (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 02.pdf: 14162361 bytes, checksum: b19921eb48893ef7a1aa4ddc2a2e1553 (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 03.pdf: 17178000 bytes, checksum: aaf5cfd215078190a7900eafd1e47790 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-07T15:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 4 Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 01.pdf: 17508857 bytes, checksum: 1d04cb16c6e33e54fe0304cecb5e491b (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 02.pdf: 14162361 bytes, checksum: b19921eb48893ef7a1aa4ddc2a2e1553 (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 03.pdf: 17178000 bytes, checksum: aaf5cfd215078190a7900eafd1e47790 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-07T15:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 4 Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 01.pdf: 17508857 bytes, checksum: 1d04cb16c6e33e54fe0304cecb5e491b (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 02.pdf: 14162361 bytes, checksum: b19921eb48893ef7a1aa4ddc2a2e1553 (MD5) Dissertação - Aparecido Ferreira de Souza - 2017 - Parte 03.pdf: 17178000 bytes, checksum: aaf5cfd215078190a7900eafd1e47790 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Iron (Fe) is an indispensable metal for most biological systems and is a target of competition in host-pathogen interactions. In humans, most Fe is complexed to the cofactor heme, present in hemoglobin, a molecule that is exploited by pathogens as an iron source. Paracoccidioides spp., a complex of thermodymorphic pathogenic fungi, are the etiological agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis endemic in Latin America. Paracoccidioides spp. are able to use hemoglobin in a receptor(PbRbt5)-mediated process. However experimental evidence points to the existence of a complex system with the presence of other proteins. In the present work, we demonstrated the similarity between PAAG_02225 (PbPga7), from Paracoccidioides lutzii, and the sequence of the heme/hemoglobin receptor Pga7 from Candida albicans, and expressed PbPga7 in Escherichia coli. Due to the presence of rare codons in P. lutzii sequence, compared to the codons preferably used by Escherichia coli, chemical synthesis of the gene was employed. The expression of PbPga7 protein opens perspectives for PbPga7 characterization. In addition, nanoUPLC-MSE was employed to analyze P. lutzii cell wall proteome. We observed that the treatment of fungus with hemoglobin promotes induction of potential adhesins and defense-related enzymes against reactive oxygen species. These data indicate that these proteins may be important for the pathogen to access hemoglobin by adhering and lysing erythrocytes, besides counteracting the toxicity generated by heme/hemoglobin released from erythrocytes, allowing the uptake and use of these molecules. The results obtained in the present work reinforce the complexity of the interaction event between pathogen and host and, in addition, contribute to broaden the understanding of the biology of Paracoccidioides spp. / O Ferro (Fe) é um metal indispensável para a maioria dos sistemas biológicos e é alvo de competição em interações patógeno-hospedeiro. Em humanos, a maioria do Fe encontra-se complexada ao cofator heme, presente na hemoglobina, uma molécula que é explorada por patógenos como uma fonte de Fe. Paracoccidioides spp., um complexo de fungos patogênicos termodimórifocos, são agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica endêmica na América Latina. Paracoccidioides spp. é hábil em utilizar hemoglobina por um processo mediado por receptor (PbRbt5). Contudo, evidências experimentais apontam para a existência de um sistema complexo com a presença de outras proteínas. No presente trabalho, foi demonstrada a similaridade de PAAG_02225 (PbPga7), de Paracoccidioides lutzii, com a sequência do receptor de heme/hemoglobina Pga7 de Candida albicans. A expressão heteróloga de PbPga7 foi realizada em Escherichia coli. Devido a presença de códons raros na sequência de P. lutzii, comparados aos códons utilizados preferencialmente por E. coli, a síntese química do gene foi empregada. A expressão da proteína PbPga7 abre perspectivas para estudos de caracterização da mesma. Adicionalmente, nanoUPLC-MSE foi utilizada para analisar o proteoma de parede celular de P. lutzii. Observou-se que o tratamento do fungo com hemoglobina promove a regulação positiva de potenciais adesinas e enzimas relacionadas com a defesa contra espécies reativas de oxigênio. Estes dados indicam que estas proteínas podem ser importantes para que o patógeno possa acessar a hemoglobina, aderindo e lisando eritrócitos, além de contrapor a toxicidade gerada pelo heme/hemoglobina liberados, permitindo a captação e utilização dessas moléculas. Os resultados obtidos no presente trabalho reiteram a complexidade do evento de interação entre patógeno e hospedeiro e, adicionalmente, contribuem para a ampliação do entendimento da biologia de Paracoccidioides spp.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-10T13:40:20Z No. of bitstreams: 1 fabianotouzdjianpinheirotavora.pdf: 2717332 bytes, checksum: ef7258702d1bc7c43c78dae666bfb284 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-11T11:35:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fabianotouzdjianpinheirotavora.pdf: 2717332 bytes, checksum: ef7258702d1bc7c43c78dae666bfb284 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T11:35:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabianotouzdjianpinheirotavora.pdf: 2717332 bytes, checksum: ef7258702d1bc7c43c78dae666bfb284 (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / A bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) consiste no agente causal da podridão negra que acomete todas as variedades comerciais do gênero Brassica, sendo responsável por perdas significativas na brassicultura nacional e mundial. O objetivo deste trabalho consistiu em traçar o perfil proteômico de dois isolados de Xcc, distintos quanto à virulência, utilizando um sistema in vitro para a identificação de proteínas diferencialmente abundantes relacionadas aos mecanismos de virulência. Inicialmente, curvas de crescimento bacteriano foram desenvolvidas afim de se determinar o momento apropriado para a coleta e extração de proteínas. Os isolados Xcc51 e XccY21 foram cultivados em dois meios de cultura distintos, sendo um nutricionalmente rico (NYG) e outro capaz de induzir a transcrição de genes relacionados à virulência (meio mínimo – XVM1), até atingirem a fase exponencial máxima de crescimento bacteriano (OD600nm = 0,8 em meio NYG e OD600nm = 0,58 em meio XVM1). As proteínas totais dos isolados foram extraídas usando fenol, precipitadas com acetato de amônio em metanol, digeridas com tripsina e analisadas pela técnica 2DnanoUPLC/MSE, utilizando a plataforma de identificação e quantificação de proteínas Protein Lynx Global Server (PLGS). Os dados obtidos foram comparados com sequências depositadas no banco de dados XGB (The Xanthomonas Genome Browser). Foram identificadas mais de 600 proteínas no proteoma total de ambos os isolados de Xcc, revelando a expressão de proteínas exclusivas, bem como um perfil diverso de proteínas aumentadas e diminuídas entre os isolados durante o cultivo nos dois meios. Com o auxílio do software BLAST2GO, foi realizada uma análise baseada na ontologia dos produtos gênicos. Os resultados obtidos evidenciam que durante a condição de indução de genes de patogenicidade, o isolado mais virulento Xcc51 se destacou pela abundância de importantes proteínas relacionadas à infecção bacteriana, como bfeA, TonB, ompP6, clpB, tig, acvB, quando comparado à quantidade exibida no isolado XccY21. Os dados proteômicos gerados pelo presente estudo apresentaram um interessante rol de proteínas diferencialmente aumentadas e supostamente relacionadas à patogenicidade e virulência de Xcc, o qual poderá nortear futuras investigações quanto aos mecanismos moleculares envolvidos na patogênese dessa fitobactéria. / The phytopathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) consist in the black rot disease causal agent, which affects all Brassica genus commercial varieties. This disease results in significant losses for brassicultures worldwide. The present study aimed to analyze the proteomic profile of two distinct Xcc isolates, employing an in vitro system for the identification of differentially abundant proteins, related to pathogenicity and virulence mechanisms. Initially, bacterial growth curves were assessed to determine the appropriate stage for protein extraction. Xanthomonas isolates Xcc51 and XccY21 were cultured in two distinct mediums, a nutritionally rich medium (NYG) and a minimal medium - XVM1, capable of inducing the transcription of pathogenicity genes, until they reached maximum exponential growth phase (OD600nm = 0.8 A. and OD600nm = 0.52 A., respectively). Total proteins were extracted using phenol/ammonium acetate, trypsin digested and analyzed by 2DnanoUPLC/MSE, coupled with Protein Lynx Global Server (PLGS). Xanthomonas Genome Browser database was used, leading to the identification of more than 600 proteins and revealing the expression of unique proteins as well as diverse profiles of increased and decreased proteins. Blast2GO software was applied to analyze gene ontology. Results suggest that during pathogenicity inducing condition, the isolate Xcc51 increases the abundance of crucial infection-related proteins such as bfeA, TonB, ompP6, clpB, acvB, when compared to XccY21 which could explain its higher virulence. The proteomic data showed by the present study delivered a list of interesting proteins presumably related with pathogenicity and virulence of Xcc, which could guide future investigations on molecular mechanisms involved in this phytobacterium pathogenesis.