As Escherichia coli enteropatogênica atípicas (EPECa) são capazes de causar a lesão A/E e não transportam o pEAF. Biofilmes microbianos são definidos como comunidades complexas formadas por microrganismos aderidos a superfícies envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a capacidade de formação de biofilme de 92 amostras de EPEC atípicas em superfícies abióticas e células pré-fixadas, utilizando três metodologias (contagem de UFC/cm2), ensaio colorimétrico com cristal violeta e CLSM). O gene shf e bfpA parecem não ter relação com a formação de biofilme. Não houve diferença significativa de formação de biofilme nas superfícies testadas. Através de CLSM foi possível verificar a formação de biofilme em EPECa. Os biofilmes visualizados em CLSM revelaram uma grande heterogeneidade das amostras. Uma metodologia qualitativa, como CLSM deve ser empregada para indicar a formação de biofilme. A adesão e formação de biofilme por EPEC atípica de longo período pode ser uma possível explicação para os casos de diarréia persistente. / The atypical Escherichia coli enteropathogenic (EPECa) are capable to cause the lesion A/E and they don\'t transport the pEAF. Microbial biofilms are defined as complex communities formed by microrganisms adhered to surfaces embedded in an exopolysacharidic matrix. The objective of this study was to verify the capacity of formation of biofilm of 92 strains of atypical EPEC in abiotics and pre-fixed cells surfaces, using three methodologies (counting of UFC/cm2), colorimetric assay with violet crystal and CLSM). The gene shf and bfpA seem not to have relationship with the biofilm formation. There was not significant difference of biofilm formation in the tested surfaces. Through CLSM it was possible to verify the biofilm formation in EPECa. The biofilms visualized in CLSM revealed a great heterogeneity of the strains. A qualitative methodology, like CLSM should be used to indicate the biofilm formation. The adhesion and biofilm formation for atypical EPEC of long period can be a possible explanation for the cases of persistent diarrhea.

Ovinos são considerados reservatórios de Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC). Este estudo pesquisou amostras de 100 carneiros no Estado de São Paulo. PCR foi empregada para detecção de stx1, stx2, eae, ehx, e intiminas. RFLP-PCR foi realizado para identificação das variantes de stx1/stx2 e fliC. Cinco isolados eae+stx- de sorotipos O128:H2, O145:H2, O153:H7 e O178:H7 apresentaram intiminas b, g e e. Cinqüenta e seis STEC foram obtidos e os genótipos foram stx1cstx2d-O118 (56,1%), stx1c (33,3%), stx2d-O118 (7,6%), e stx1cstx2dOX3a (3%). Os sorotipos mais freqüentes foram ONT:H8, ONT:H-, O75:H-, O174:H8 e O5:H-. Gene fliC codificando para H2, H8, H14, H16, H19, H21 ou H28 foi identificado em 25/33 isolados. ehx foi detectado em três/cinco EPEC Atípicas e em 38 (57,6%) STEC. Sensibilidade aos antimicrobianos foi observada em 77,2% dos isolados STEC. A análise da similaridade genética por PFGE revelou 24 perfis entre 40 isolados STEC e EPEC atípicas. O estudo demonstrou que ovinos saudáveis podem se comportar como reservatórios de STEC e EPEC atípica. / Lambs are reported as carriers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) worldwide. This study surveyed 100 sheep in São Paulo, Brazil. PCR was used for detection of stx1, stx2, eae, ehx, and intimins. RFLP-PCR investigated the stx1/stx2 variants and flagellar antigen (fliC). Five isolates were eae+/stx-, belonging to serotypes O128:H2, O145:H2, O153:H7 and O178:H7, harboring b, g and e intimins. Fifty-six STEC isolates were recovered, and stx genotypes were stx1cstx2d-O118 (56.1%), stx1c (33.3%), stx2d-O118 (7.6%), and stx1cstx2dOX3a (3%). A diversity of STEC serotypes was observed, but most frequent were ONT:H8, ONT:H-, O75:H-, O174:H8 and O5:H-. fliC gene coding for H2, H8, H14, H16, H19, H21 or H28 was identified in 25/33 isolates. ehx gene was detected in three Atypical EPEC and in 38 (57,6%) STEC. Fifty-one (77.2%) STEC were susceptible to antimicrobials tested. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) revealed 24/40 profiles. The study showed that healthy ovine can be carrier of STEC and atypical EPEC in Brazil.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes de diarréia em crianças nos países em desenvolvimento. Esse patótipo pode ser classificado em dois grupos: EPEC típica (t-EPEC) e EPEC atípica (a-EPEC). O objetivo principal deste estudo foi traçar o perfil plasmidial de 78 amostras de a-EPEC bem como investigar em 72 amostras a presença de genes de virulência descritos em outros patótipos de DEC para procura de um marcador de virulência específico deste grupo de amostras. Foi detectada a presença de alguns genes de virulência como: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). Os perfis plasmidiais obtidos permitiram verificar que entre as 78 amostras analisadas, 12 não possuem plasmídio, 33 possuem plasmídios entre 50 a 90 kb e 38 possuem plasmídios entre 90 a 124 kb. A pesquisa dos grupos de incompatibilidade revelou que os grupos IncFIB e IncF são os mais freqüentes entre as amostras de a-EPEC. Os resultados de RFLP do DNA plasmidial das amostras do sorotipo O55:H7 sugeriu que existem seqüências de nucleotídeos comuns entre os plasmídios. Os dados obtidos também permitiram inferir a existência de fragmentos de DNA plasmidial comum entre amostras de EHEC O157:H7 e amostras de a-EPEC O55:H7. A função biológica dos plasmídios de a-EPEC e a relação com o plasmídio pO157 necessitam de estudos complementares. / Escherichia coli (EPEC) is one of the main agents of diarrhea in children in developing countries. This pathotype can be classified in two groups: typical EPEC (t-EPEC) and atypical EPEC (a-EPEC). The aim of this study was to determine the plasmid profile of 78 strains of a-EPEC and investigate 72 strains for the presence of virulence genes described in other DEC. It was detected the presence of some virulence genes: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). The plasmid profiles obtained allowed us to verify that among the 78 samples analyzed, 12 did not have plasmids, 33 strains have plasmids ranging between 50 and 90 kb, and 38 have plasmids ranging between 90 to 124 kb. Incompatibility groups analysis revealed that IncFIB and IncF groups are the most frequent among the samples of a-EPEC. RFLP analysis of plasmid DNA of strains of serotype O55:H7 suggested that there are nucleotide sequences common to the plasmids. The data also allowed inferring the existence of fragments of plasmid DNA common to EHEC O157:H7 and a-EPEC O55:H7. The biological function of aEPEC plasmid and the relationship with pO157 requires further studies.

Ovinos são considerados reservatórios de Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC). Este estudo pesquisou amostras de 100 carneiros no Estado de São Paulo. PCR foi empregada para detecção de stx1, stx2, eae, ehx, e intiminas. RFLP-PCR foi realizado para identificação das variantes de stx1/stx2 e fliC. Cinco isolados eae+stx- de sorotipos O128:H2, O145:H2, O153:H7 e O178:H7 apresentaram intiminas b, g e e. Cinqüenta e seis STEC foram obtidos e os genótipos foram stx1cstx2d-O118 (56,1%), stx1c (33,3%), stx2d-O118 (7,6%), e stx1cstx2dOX3a (3%). Os sorotipos mais freqüentes foram ONT:H8, ONT:H-, O75:H-, O174:H8 e O5:H-. Gene fliC codificando para H2, H8, H14, H16, H19, H21 ou H28 foi identificado em 25/33 isolados. ehx foi detectado em três/cinco EPEC Atípicas e em 38 (57,6%) STEC. Sensibilidade aos antimicrobianos foi observada em 77,2% dos isolados STEC. A análise da similaridade genética por PFGE revelou 24 perfis entre 40 isolados STEC e EPEC atípicas. O estudo demonstrou que ovinos saudáveis podem se comportar como reservatórios de STEC e EPEC atípica. / Lambs are reported as carriers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) worldwide. This study surveyed 100 sheep in São Paulo, Brazil. PCR was used for detection of stx1, stx2, eae, ehx, and intimins. RFLP-PCR investigated the stx1/stx2 variants and flagellar antigen (fliC). Five isolates were eae+/stx-, belonging to serotypes O128:H2, O145:H2, O153:H7 and O178:H7, harboring b, g and e intimins. Fifty-six STEC isolates were recovered, and stx genotypes were stx1cstx2d-O118 (56.1%), stx1c (33.3%), stx2d-O118 (7.6%), and stx1cstx2dOX3a (3%). A diversity of STEC serotypes was observed, but most frequent were ONT:H8, ONT:H-, O75:H-, O174:H8 and O5:H-. fliC gene coding for H2, H8, H14, H16, H19, H21 or H28 was identified in 25/33 isolates. ehx gene was detected in three Atypical EPEC and in 38 (57,6%) STEC. Fifty-one (77.2%) STEC were susceptible to antimicrobials tested. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) revealed 24/40 profiles. The study showed that healthy ovine can be carrier of STEC and atypical EPEC in Brazil.

As Escherichia coli enteropatogênica atípicas (EPECa) são capazes de causar a lesão A/E e não transportam o pEAF. Biofilmes microbianos são definidos como comunidades complexas formadas por microrganismos aderidos a superfícies envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a capacidade de formação de biofilme de 92 amostras de EPEC atípicas em superfícies abióticas e células pré-fixadas, utilizando três metodologias (contagem de UFC/cm2), ensaio colorimétrico com cristal violeta e CLSM). O gene shf e bfpA parecem não ter relação com a formação de biofilme. Não houve diferença significativa de formação de biofilme nas superfícies testadas. Através de CLSM foi possível verificar a formação de biofilme em EPECa. Os biofilmes visualizados em CLSM revelaram uma grande heterogeneidade das amostras. Uma metodologia qualitativa, como CLSM deve ser empregada para indicar a formação de biofilme. A adesão e formação de biofilme por EPEC atípica de longo período pode ser uma possível explicação para os casos de diarréia persistente. / The atypical Escherichia coli enteropathogenic (EPECa) are capable to cause the lesion A/E and they don\'t transport the pEAF. Microbial biofilms are defined as complex communities formed by microrganisms adhered to surfaces embedded in an exopolysacharidic matrix. The objective of this study was to verify the capacity of formation of biofilm of 92 strains of atypical EPEC in abiotics and pre-fixed cells surfaces, using three methodologies (counting of UFC/cm2), colorimetric assay with violet crystal and CLSM). The gene shf and bfpA seem not to have relationship with the biofilm formation. There was not significant difference of biofilm formation in the tested surfaces. Through CLSM it was possible to verify the biofilm formation in EPECa. The biofilms visualized in CLSM revealed a great heterogeneity of the strains. A qualitative methodology, like CLSM should be used to indicate the biofilm formation. The adhesion and biofilm formation for atypical EPEC of long period can be a possible explanation for the cases of persistent diarrhea.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes de diarréia em crianças nos países em desenvolvimento. Esse patótipo pode ser classificado em dois grupos: EPEC típica (t-EPEC) e EPEC atípica (a-EPEC). O objetivo principal deste estudo foi traçar o perfil plasmidial de 78 amostras de a-EPEC bem como investigar em 72 amostras a presença de genes de virulência descritos em outros patótipos de DEC para procura de um marcador de virulência específico deste grupo de amostras. Foi detectada a presença de alguns genes de virulência como: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). Os perfis plasmidiais obtidos permitiram verificar que entre as 78 amostras analisadas, 12 não possuem plasmídio, 33 possuem plasmídios entre 50 a 90 kb e 38 possuem plasmídios entre 90 a 124 kb. A pesquisa dos grupos de incompatibilidade revelou que os grupos IncFIB e IncF são os mais freqüentes entre as amostras de a-EPEC. Os resultados de RFLP do DNA plasmidial das amostras do sorotipo O55:H7 sugeriu que existem seqüências de nucleotídeos comuns entre os plasmídios. Os dados obtidos também permitiram inferir a existência de fragmentos de DNA plasmidial comum entre amostras de EHEC O157:H7 e amostras de a-EPEC O55:H7. A função biológica dos plasmídios de a-EPEC e a relação com o plasmídio pO157 necessitam de estudos complementares. / Escherichia coli (EPEC) is one of the main agents of diarrhea in children in developing countries. This pathotype can be classified in two groups: typical EPEC (t-EPEC) and atypical EPEC (a-EPEC). The aim of this study was to determine the plasmid profile of 78 strains of a-EPEC and investigate 72 strains for the presence of virulence genes described in other DEC. It was detected the presence of some virulence genes: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). The plasmid profiles obtained allowed us to verify that among the 78 samples analyzed, 12 did not have plasmids, 33 strains have plasmids ranging between 50 and 90 kb, and 38 have plasmids ranging between 90 to 124 kb. Incompatibility groups analysis revealed that IncFIB and IncF groups are the most frequent among the samples of a-EPEC. RFLP analysis of plasmid DNA of strains of serotype O55:H7 suggested that there are nucleotide sequences common to the plasmids. The data also allowed inferring the existence of fragments of plasmid DNA common to EHEC O157:H7 and a-EPEC O55:H7. The biological function of aEPEC plasmid and the relationship with pO157 requires further studies.

O aumento dos casos de diarreia causados por EPECa evoca a sua capacidade de adaptação e patogenicidade. O objetivo deste estudo foi investigar o comportamento da EPECa na interação com macrófagos (fagocitose e antifagocitose). O estudo da fagocitose das cepas LB7 (O55:H7), LB13 (O111:abH9) e BA487 (O55:H7) em macrófagos J774A1 mostrou sobrevivência intracelular em presença de NO. EPECa impede a maturação do vacúolo parasitóforo. A sobrevivência em macrófago derivado de C3H/HeJ, mutante do tlr4, foi reduzida e em macrófago de C57BL/6 não foi observada. O fator antigagocítico (Fa) secretado pela LB7, já detectado pelo grupo, apresenta natureza peptídica e a sua ação não é específica de EPEC, pois inibe também a fagocitose de Shigella e látex. A secreção do Fa foi avaliada em M9 e DMEM. O produto do fracionamento do sobrenadante do cultivo por SPE apresentou Fa em ambos meios. No entanto, a secreção em M9 é baixa e não foi detectada por HPLC. O Fa do DMEM obtido por HPLC mostrou-se citotóxico. Novos meios de cultivo deverão ser estudados para a identificação do Fa. / The increase in the numbers of diarrhea cases caused by aEPEC denotes its adaptability and pathogenicity. The objective of this study was to investigate the behavior of aEPEC in the interaction with macrophages (phagocytosis and anti-phagocytosis). Strains LB7 (O55:H7), LB13 (O111:abH9) and BA487 (O55:H7) were shown to survive within J774A1 macrophages in the presence of NO. aEPEC prevents maturation of the parasitophorus vacuole. Survival inside C3H/HeJ derived macrophages, mutant for tlr4, decreased and was not observed in C57BL/6 derived macrophages. The anti-phagocytic factor (AF), secreted by LB7 and previously detected by our group, is peptidic and its action is not specific to EPEC as it also inhibits phagocytosis of Shigella and latex. Secretion of AF was evaluated in M9 and DMEM. AF was detected after SPE fractionation of both culture media. However, the secretion in M9 is low and was not detected by HPLC. The DMEM HPLC fraction containing AF was cytotoxic. New culture media will be studied for the identification of AF.

EPECa tem sido identificada como o principal agente de diarreia aguda em crianças de países em desenvolvimento. Biofilmes são estruturas bacterianas envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a influência de diferentes condições de cultivo na formação de biofilme por EPECa isoladas de crianças com diarreia e pesquisar a presença de genes relacionados com a formação de biofilme. As sequências genéticas dos genes csgA, crl, fimH e bcsA foram pesquisadas através da PCR e verificadas em 6 (26%), 23 (100%), 22 (95,6%) e 23 (100%) das amostras respectivamente. A formação de biofilme em placas de MTP por EPECa foi melhor evidenciada em meio LB sem sal a 26 °C e em caldo E. coli a 37 °C, tanto em número de amostras quanto em intensidade da formação de biofilme. As microscopias confocal e de varredura propiciaram uma análise qualitativa de microcolônias e pilares, além de EPS respectivamente. As condições de cultivo devem ser usadas com precaução para realmente aferir a capacidade de formação de biofilme por amostras de EPECa. / aEPEC has been identified as the main agent of acute diarrhea in children in developing countries. Biofilms are bacterial structures which are surrounded by a matrix of exopolysaccharides. The aim of this study was investigate the influence of different culture conditions on biofilm formation by 23 aEPEC strains isolated from children with diarrhea and search for the presence of genes related to biofilm formation. The genetic sequences of the csgA, crl, fimH and bcsA genes were screened by PCR and were found in 6 (26%), 23 (100%) 22 (95.6%) and 23 (100%) of the strains respectively. Biofilm formation in MTP plates for aEPEC strains was better evidenced in LB medium without NaCl at 26 ° C and in E. coli broth at 37 ° C, both in number and intensity of biofilm formation. The confocal and scanning electron microscopy provided a qualitative analysis of structures such as microcolonies and pillars, and respectively EPS. The growing conditions should be used with caution to measure the real ability of biofilm formation by strains of aEPEC.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:54Z : No. of bitstreams: 1 Publico-115.pdf: 983090 bytes, checksum: 7f674d882f7cc66c5e1e6fe6b081c85c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e Programa Brasil Alemanha / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) produz lesão attaching/effacing (A/E) em células eucarióticas mediada pela adesina de membrana externa intimina. EPEC são sub-agrupadas em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC). Recentemente demonstramos que a amostra de aEPEC 1551-2 (sorotipo O não-tipável, não-móvel) invade células HeLa por um processo dependente da expressão de intimina do subtipo omicron. Neste estudo, avaliamos se amostras de aEPEC expressando diferentes subtipos de intimina também são invasoras utilizando ensaios quantitativos de proteção com gentamicina. Também avaliamos se aEPECs invadem células intestinais diferenciadas T84 e Caco-2. Cinco das seis amostras testadas invadiram células HeLa e T84 numa faixa de 13.3%-20.9% e 5.8%-17.8%, respectivamente, do total de bactérias associadas às células. As amostras estudadas foram significantemente mais invasoras que a amostra protótipo de tEPEC E2348/69 (1.4% e 0.5% em células HeLa e T84, respectivamente). A amostra 1551-2 foi ainda testada em células Caco-2 diferenciadas, o que resultou num índice de invasão semelhante àqueles obtidos em células T84 (7,5%±1,7) e também significantemente maior que a tEPEC E2348/69 (1,8%±0,6). A invasão de células T84 foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos ainda que a invasão de células HeLa por aEPEC 1551-2 depende de filamentos de actina, mas não de microtúbulos. Além disso, a infecção de monocamadas não diferenciadas e o rompimento das tight junctions aumentaram a eficiência da invasão de células T84, sugerindo uma via de invasão preferencial pela superfície não diferenciada. Em resumo, amostras de aEPEC podem invadir cultura de células in vitro com eficiência variável e independentemente de subtipo de intimina. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) produce attaching/effacing (A/E) lesions on eukaryotic cells mediated by the outer membrane adhesin Intimin. EPEC are subgrouped into typical (tEPEC) and atypical (aEPEC). We have recently demonstrated that aEPEC strain 1551-2 (serotype O non-typable, non-motile) invades HeLa cells by a process dependent on the expression of intimin subtype omicron. In this study, we evaluated whether aEPEC strains expressing other intimin subtypes are also invasive using the quantitative gentamicin protection assay. We also evaluated whether aEPEC invade intestinal differentiated T84 cells. Five of six strains invaded HeLa and T84 cells in a range of 13.3%-20.9% and 5.8%-17.8%, respectively, of the total cellassociated bacteria. The strains studied were significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.4% and 0.5% in HeLa and T84 cells, respectively). aEPEC strain 1551-2 was also tested in differentiated Caco-2 cells, resulting in an invasion index similar to that obtained in T84 cells (7.5%±1.7%). This strain was also significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.8%±0.6%). Invasiveness of T84 cells was confirmed by transmission electron microscopy. We also showed that invasion of HeLa cells by aEPEC 1551-2 depended on actin filaments, but not on microtubules. In addition, infection of non-differentiated monolayers and disruption of tight junctions enhanced its invasion efficiency in T84 cells, suggesting preferential invasion via a non-differentiated surface. In summary, aEPEC strains may invade intestinal cells in vitro with varying efficiencies and independently of the intimin subtype. / CAPES - Probral: 281/07 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

EPECa tem sido identificada como o principal agente de diarreia aguda em crianças de países em desenvolvimento. Biofilmes são estruturas bacterianas envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a influência de diferentes condições de cultivo na formação de biofilme por EPECa isoladas de crianças com diarreia e pesquisar a presença de genes relacionados com a formação de biofilme. As sequências genéticas dos genes csgA, crl, fimH e bcsA foram pesquisadas através da PCR e verificadas em 6 (26%), 23 (100%), 22 (95,6%) e 23 (100%) das amostras respectivamente. A formação de biofilme em placas de MTP por EPECa foi melhor evidenciada em meio LB sem sal a 26 °C e em caldo E. coli a 37 °C, tanto em número de amostras quanto em intensidade da formação de biofilme. As microscopias confocal e de varredura propiciaram uma análise qualitativa de microcolônias e pilares, além de EPS respectivamente. As condições de cultivo devem ser usadas com precaução para realmente aferir a capacidade de formação de biofilme por amostras de EPECa. / aEPEC has been identified as the main agent of acute diarrhea in children in developing countries. Biofilms are bacterial structures which are surrounded by a matrix of exopolysaccharides. The aim of this study was investigate the influence of different culture conditions on biofilm formation by 23 aEPEC strains isolated from children with diarrhea and search for the presence of genes related to biofilm formation. The genetic sequences of the csgA, crl, fimH and bcsA genes were screened by PCR and were found in 6 (26%), 23 (100%) 22 (95.6%) and 23 (100%) of the strains respectively. Biofilm formation in MTP plates for aEPEC strains was better evidenced in LB medium without NaCl at 26 ° C and in E. coli broth at 37 ° C, both in number and intensity of biofilm formation. The confocal and scanning electron microscopy provided a qualitative analysis of structures such as microcolonies and pillars, and respectively EPS. The growing conditions should be used with caution to measure the real ability of biofilm formation by strains of aEPEC.