L'α-synucléine est reconnue comme une protéine clé dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson ainsi que d'autres troubles neurodégénératifs appelés synucléinopathies. Dans ces maladies, la surexpression de l’α-synucléine entraîne la formation d'agrégats toxiques dans les neurones dopaminergiques (DA). Dans cette thèse, nous avons exploré l’effet de la régulation de microARN (miARN) sur l’expression de l’α-synucléine. Pour se faire, des études ont été menées avec la lignée cellulaire humaine SH-SY5Y qui peut être différenciée pour créer un modèle de neurones DA et ensuite traitée avec une neurotoxine pour induire des caractéristiques cellulaires de la maladie de Parkinson. Des observations importantes ont été supportées dans des modèles cellulaires plus avancés, notamment les neurones induits par reprogrammation directe de fibroblastes humains (iNs) et les neurones DA primaires de souris purifiés.
Le premier objectif était de mieux comprendre comment la surexpression aberrante de l'α synucléine dans les synucléinopathies pourrait être due à une dérégulation de la maturation des miARN qui ciblent son ARN messager. Tout d’abord, nous avons sélectionné les miARN les plus susceptibles d'avoir un effet régulateur sur l’expression de l’α-synucléine à partir de recherche de la littérature et d’analyse de bases de données spécialisées. Nous avons observé que l’augmentation de l'expression de l'α-synucléine associée à l’ajout de neurotoxine est accompagnée d’une diminution concomitante de l'expression de plusieurs miARN sélectionnés. Sur la base de ces résultats, l'impact de ces miARN sur l'expression de l'α-synucléine a été évalué dans plusieurs types de cellules humaines, notamment les HEK 293T, les SH-SY5Y différenciées et les iNs. À cette fin, nous avons utilisé des cibles de miARN exogènes pour réprimer l'activité régulatrice des miARN et avons mesuré leur effet sur l'expression de l'α synucléine. Ainsi, nous avons démontré que la répression de miR-7, miR-93, miR-140, miR 153 et miR 214 mène systématiquement à la surexpression de l’α-synucléine dans les différents types de cellules. De plus, nous avons démontré que certains miARN sont régulés de manière post-transcriptionnelle en mesurant les niveaux des formes immatures et matures des miARN dans différents contextes cellulaires.
Le deuxième objectif était d’identifier des protéines potentiellement aptes à réguler la maturation post-transcriptionnelle de miARN. Des études de purification par affinité et de spectrométrie de masse ont permis d'identifier les protéines qui s’associent avec la tige-boucle des formes immatures des miARN et régulent potentiellement leur maturation. Quelques protéines candidates ont été sélectionnées sur la base d’analyse informatique pour examiner l’effet de leur surexpression dans différents essais cellulaires. À ce jour, nous avons identifié quatre protéines (MIF, PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) qui, en plus de répondre à certains critères de bases (lient l’ARN, sont présentes dans le cerveau et impliquées dans des maladies associées au système nerveux), ont un effet sur l’activité et l’expression de miR-153 ainsi que sur l’expression de l’α-synucléine.
Ces travaux ont permis d’établir de solides bases dans notre compréhension de la régulation de l'α-synucléine par les miARN et d’ouvrir la voie à des études plus élaborées qui permettront d’établir les mécanismes de régulation des niveaux de miARN qui ciblent l’α-synucléine. À plus long terme, cet axe de recherche pourrait fournir des pistes pour le développement d'outils diagnostiques et thérapeutiques pour les synucléinopathies. / Alpha-synuclein is a key protein in the pathophysiology of Parkinson's disease and other
neurodegenerative disorders called synucleinopathies. In these diseases, overexpression of α-synuclein
leads to the formation of toxic aggregates in dopaminergic (DA) neurons. In this thesis, we explored the
effect of microRNA (miRNA) regulation on α-synuclein expression. To do so, studies were conducted
with the human SH-SY5Y cell line, which can be differentiated to create a model of DA neurons and
then treated with a neurotoxin to induce cellular features of Parkinson's disease. Important observations
were supported in more advanced cell models, including neurons induced by direct reprogramming of
human fibroblasts (iNs) and purified primary mouse DA neurons.
The first objective was to better understand how aberrant overexpression of α-synuclein in
synucleinopathies results in the deregulation of the maturation of miRNAs that target its messenger RNA.
First, we selected the miRNAs most likely to have a regulatory effect on α-synuclein expression based
on literature searches and specialized database analyses. We observed that the increase in α-synuclein
expression associated with neurotoxin addition is accompanied by a concomitant decrease in the
expression level of several selected miRNAs. Based on these results, the impact of these miRNAs on αsynuclein expression was evaluated in several human cell types, including HEK 293T, differentiated SHSY5Y, and iNs. To this end, we used exogenous miRNA targets to repress miRNA regulatory activity
and measured their effect on α-synuclein expression. Thus, we demonstrated that repression of miR-7,
miR-93, miR-140, miR-153, and miR-214 consistently leads to overexpression of α-synuclein in
different cell types. In addition, we demonstrated that some miRNAs are regulated in a posttranscriptional manner by measuring the levels of immature and mature forms of miRNAs in different
cellular contexts. The second objective was to identify proteins potentially able to regulate the post-transcriptional
maturation of miRNAs. Affinity purification and mass spectrometry studies were used to identify
proteins that associate with the stem-loop of immature forms of miRNAs and potentially regulate their
maturation. A few candidate proteins were selected based on computational analysis to examine the effect
of their overexpression in different cell-based assays. To date, we have identified four proteins (MIF,
PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) that, in addition, to fitting basic criteria (known to bind RNA, are present
in the brain and associated with nervous system-related diseases) affect miR-153 activity and expression
as well as α-synuclein expression.
This work has established a solid foundation in our understanding of the regulation of α-synuclein
by miRNAs and has paved the way for more elaborate studies that will establish the mechanisms of
regulation of miRNA levels that target α-synuclein. In the longer term, this line of research could provide
avenues for the development of diagnostic and therapeutic tools for synucleinopathies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32964 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Salvail-Lacoste, Alix |
| Contributors | Legault, Pascale |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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