Le récepteur ionotropique P2X[indice inférieur 7] (P2X[indice inférieur 7]R) est impliqué dans divers rôles physiologiques tels la prolifération, l'apoptose, la réponse inflammatoire et le trafic membranaire dans plusieurs types cellulaires. Cependant, peu est connu quant aux rôles physiologiques du P2X[indice inférieur 7]R dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs). Dans la littérature scientifique, le P2X[indice inférieur 7]R est connu pour activer la protéine kinase Dl (PKD1/PKC[mu]) qui est impliquée dans le transport des protéines membranaires. Comme l'un des rôles physiologiques majeurs des CEIs est le transport et l'absorption du glucose, le transporteur à glucose de type 2 (Glut2) a été ciblé afin d'étudier son transport membranaire suite à l'activation du P2X[indice inférieur 7]R. Glut2 est un élément clé dans le métabolisme du glucose par les CEIs. Une hypothèse stipulant que le P2X[indice inférieur 7]R serait impliqué dans le trafic membranaire de Glut2 par une voie dépendante de la PKD1/PKC[mu] a été émise. Les objectifs majeurs de l'étude étaient de déterminer le profil d'expression du P2X[indice inférieur 7]R selon le stade de différenciation des CEIs, d'élucider les mécanismes moléculaires régulant l'expression du P2X[indice inférieur 7]R, d'étudier la signalisation intracellulaire affectant l'expression membranaire de Glut2 induite par l'activation du P2X[indice inférieur 7]R. D'abord, le profil d'expression du P2X[indice inférieur 7]R en fonction de la différenciation des CEIs a été déterminé par immunofluorescence indirecte sur des sections de jéjunum de souris normales et par immunobuvardage de type western sur des lysats de cellules Caco-2/15 prolifératives et différenciées. Ensuite, la signalisation induite par l'activation du P2X[indice inférieur 7]R a été étudiée en stimulant des cellules IEC-6 avec de l'ATP ou du BzATP, deux agonistes du P2X[indice inférieur 7]R, et en prétraitant les cellules avec de l'oATP, un antagoniste du P2X[indice inférieur 7]R. Différents inhibiteurs pharmacologiques tels le UO126 (MEK1/2) et la rottlerine (PKC[delta]) ont été utilisés pour déterminer l'ordre des protéines dans les voies de signalisation. Également, différents chélateurs de calcium, comme le BAPTA-AM et l'EGTA, ont été utilisés pour étudier la dépendance des voies trouvées au calcium. L'expression de Glut2 à la membrane plasmique suite à la stimulation du P2X[indice inférieur 7]R a été étudiée par immunofluorescence indirecte et par biotinylation des protéines membranaires de surface. Finalement, la régulation transcriptionnelle du P2X[indice inférieur 7]R dans les cellules HEK 293T et Caco-2/15 a été étudiée par des essais luciférase qui permettent de visualiser l'interaction entre le promoteur du P2X[indice inférieur 7]R et des facteurs de transcription cibles comme Cdx-2, GATA-4, HNF-4[alpha], C/EBP[alpha] et C/EBP[bêta]. Les résultats obtenus démontrent que l'expression du P2X[indice inférieur 7]R augmente en fonction de l'état de différenciation des cellules Caco-2/15, ce qui coïncide avec sa localisation dans les deux tiers supérieurs de la villosité de jéjunum de souris normales. Aussi, l'activation du P2X[indice inférieur 7]R amène une augmentation de la phosphorylation des protéines PKD1/PKC[mu], PKC[delta], ERK1/2, MEK1/2, SAPK/JNK, p90RSK et CREB. Également, la PKC[delta] est en amont des protéines MEK1/2 et ERK1/2 qui elles-mêmes sont en amont de la PKD1/PKC[mu]. Cette voie PKC[delta]/MEK/ERK/PKD est également indépendante du calcium extracellulaire et intracellulaire. Aussi, il y a internalisation et diminution de l'expression membranaire de Glut2 suite à l'activation du P2X[indice inférieur 7]R par le BzATP. Finalement, le P2X[indice inférieur 7]R est régulé au niveau transcriptionnel par les facteurs de transcription HNF-4[alpha], C/EBP[alpha] et C/EBP[bêta] mais pas par Cdx-2 et GATA-4. En résumé, les résultats démontrent que le P2X[indice inférieur 7]R est impliqué dans l'internalisation et la diminution de l'expression membranaire de Glut2 par un mécanisme qui semble dépendant de la voie PKC[delta]/MEK/ERK/PKD calcium-indépendante.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usherbrooke.ca/oai:savoirs.usherbrooke.ca:11143/4034 |
| Date | January 2009 |
| Creators | L'Ériger, Karine |
| Contributors | Gendron, Fernand-Pierre |
| Publisher | Université de Sherbrooke |
| Source Sets | Université de Sherbrooke |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Mémoire |
| Rights | © Karine L'Ériger |
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