Doctor en Farmacología / Diversos estudios clínicos han revelado que las tiazolidinedionas, fármacos
para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 y resistencia a insulina, podrían reducir
la morbimortalidad cardiovascular. Su mecanismo de acción es a través de la
activación de los Receptores Activados por Proliferadores Peroxisomales (PPARs),
los cuales son factores transcripcionales activados por ligandos. En el sistema
cardiovascular, los PPARs se expresan de forma variable y juegan un importante
papel en la regulación del metabolismo energético y en la respuesta inflamatoria.
Durante diversos estados patológicos como por ejemplo en el infarto al miocardio,
el tratamiento con tiazolidinedionas ha mostrado efectos cardioprotectores ya que
reducen la hipertrofia y el área infartada y atenúan la respuesta inflamatoria
cardiaca. Estos antecedentes sugieren un importante papel de PPARγ durante el
remodelado cardiaco, proceso fisiopatológico que consiste en un cambio estructural
y funcional del tejido, caracterizado por fibrosis, hipertrofia y pérdida progresiva de
los cardiomiocitos.
Se ha sugerido que la apoptosis es el principal mecanismo de muerte celular
en el corazón pero últimamente se ha avanzado en los estudios de la participación
de la autofagia o “muerte programada de tipo II”. Sin embargo, la autofagia se
describió inicialmente como un proceso fisiológico clave para la sobrevida celular
durante la privación de aminoácidos, diferenciación celular y desarrollo. Consiste
en un proceso dinámico y programado que procede con el secuestro de proteínas
citoplasmáticas y organelos enteros dentro de vacuolas de doble membrana, que
posteriormente se fusionan con los lisosomas formando los autolisosomas. Todos
estos elementos capturados en las vacuolas son degradados por proteasas
lisosomales y removidos de la célula por exocitosis. Evidencias recientes han mostrado que los agonistas de PPARγ podrían inducir la autofagia en algunas
líneas celulares. Sin embargo, aún no queda claro si la autofagia es realmente un
proceso de muerte o un mecanismo de sobrevida celular. Dado que prácticamente
se desconoce si la activación de PPARγ regula la autofagia cardiaca, en esta tesis
se postuló como hipótesis que “El agonista farmacológico de PPARγ rosiglitazona
induce la autofagia del cardiomiocito, protegiéndolo de la muerte”.
Los objetivos específicos propuestos fueron:
• Estudiar in vitro el efecto de agonistas farmacológicos de PPARα y/o PPARγ en la
viabilidad del cardiomiocito de rata.
• Determinar si rosiglitazona induce autofagia en el cardiomiocito y si ésta se relaciona
con sobrevida celular.
• Investigar si la estimulación con rosiglitazona afecta la viabilidad de cardiomiocitos
expuestos a estrés nutricional, estrés hiperosmótico o a isquemia/reperfusión
simulada.
El modelo experimental utilizado fue cultivo primario de cardiomiocitos de ratas
neonatas tratados con rosigllitazona en un rango creciente de concentraciones y de
tiempo. La autofagia se evaluó mediante procesamiento de la proteína LC3 endógena,
cambio en la distribución y degradación de la proteína GFP-LC3 en cardiomiocitos
transducidos con el adenovirus GFP-LC3.
Los resultados mostraron que PPARγ está presente en cardiomiocitos de ratas
y que es transcripcionalmente activo, lo cual se demostró mediante un plasmidio
reportero que contiene el elemento de respuesta para este factor transcripcional.
Además, rosiglitazona estimuló temprana y progresivamente la autofagia en los cultivos
primarios de cardiomiocitos, determinada por el procesamiento de la proteína
endógena LC3-I, efecto similar al observado en repuesta al tratamiento con rapamicina.
Rosiglitazona también incrementó la distribución punteada de LC3-GFP, sin embargo no disminuyó la fluorescencia de la proteína LC3-GFP en los cardiomiocitos
transducidos con el adenovirus LC3-GFP. Por otra parte, rosiglitazona no modificó de
forma significativa los niveles intracelulares de ATP y ni afectó la viabilidad basal del
cardiomiocito. El tratamiento con gemfibrozilo, tampoco modificó su viabilidad.
Para determinar si la inducción de autofagia tiene un efecto en la viabilidad
del cardiomiocito, los cultivos celulares se expusieron a estrés mecánico por
hiperosmolaridad y se midió la viabilidad. El estrés hiperosmótico indujo de manera
rápida y potente la muerte de las células cardiacas. Sin embargo, rosiglitazona y
gemfibrozilo no previnieron este efecto. La muerte de las células cardiacas inducida
por el estrés hiperosmótico es mediante apoptosis, lo que se demostró la
evaluación por citometría de flujo de la subpoblación G1 en células permeabilizadas
y tratadas con yoduro de propidio y determinación de potencial mitocondrial.
Rosiglitazona y gemfibrozilo no previnieron la apoptosis del cardiomiocito inducida
por estrés hiperosmótico. Rosiglitazona tampoco bloqueó la muerte celular
inducida por isquemia y reperfusión simulada.
Finalmente, los resultados obtenidos con el desarrollo de esta tesis permiten
concluir que rosiglitazona induce la autofagia del cardiomiocito pero que ésta es
insuficiente para modificar la viabilidad celular / Clinical studies showed that thiazolidinediones, drugs used for type 2 diabetes
and insulin resistance treatment, can reduce cardiovascular morbid and mortality.
These compounds are highly specific ligands of peroxisome proliferator-activator
receptor gamma (PPARγ), a nuclear hormone receptor superfamily member. PPARs
are variably expressed in the cardiovascular system and play an important role in both
energetic metabolism regulation and inflammation response. In myocardial infarct,
treatment with thiazolidinediones has cardioprotective effects reducing cardiac
hypertrophy, infarcted area and inflammatory response. These data suggest an
important role of PPARγ during cardiac remodeling. Remodeling is a
physiopathological alteration in heart structure and function characterized by
cardiomyocytes fibrosis, hypertrophy and death.
Apoptosis has been described as the main cardiac cell death mechanism.
However, recent studies have also described the participation of autophagy, also known
as type II programmed cell death. Autophagy was first described as an adaptative
physiological process during amino acids starvation. It has also been described its
participation in cellular differentiation and development. Autophagy consists in the
sequestration of cytoplasm portions and organelles within double membrane vesicles,
named autophagosomes. These vesicles were subsequently fused with lysosomes
forming the autofagosomes. All elements captured in these vesicles are degraded by
lysosomal proteases and removed by exocytosis. Recent evidence has shown that
PPARγ agonists could induce autophagy in some cells lines. However, is not clear
whether autophagy is a mechanism for cell survival or death. Based on these
antecedents we postulated the following hypothesis: “The pharmacological PPARγ
agonist, rosiglitazone, induces cardiomyocyte autophagy protecting them from cell
death”. The specific aims were:
• To study in vitro the effects of PPARα and PPARγ pharmacological agonists on
neonatal rat cardiomyocytes.
• To determine whether rosiglitazone induces autophagy in cardiomyocyte and
whether this process is related with cell viability.
• To investigate if the stimulation with rosiglitazone affects cardiomyocyte viability
when exposed to nutritional stress, hyperosmotic stress and simulated
ischemia/reperfusion.
The experimental models were primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes
treated with rosiglitazone at different concentrations and times. Autophagy was
evaluated by endogenous LC3-I processing, and by change in adenoviral expressing
GFP-LC3 distribution and degradation.
Results showed that PPARγ is expressed and is transcriptionally active in
neonatal rat cardiomyocytes as determined by western blot and activity of PPAR
reporter plasmid. Furthermore, rosiglitazone stimulated early and progressively
cardiac autophagy as determined by endogenous LC3-I processing. This effect was
similar to that induced by rapamycin. Rosiglitazone also increased the GFP-LC3
punctuated pattern, but without decreasing GFP-LC3 fluorescence. On the other
hand, rosiglitazone neither affects ATP levels nor viability of cardiomyocytes.
Gemfibrozil treatment, also did not affect cardiomyocyte viability.
To determine whether autophagy affects cardiomyocyte viability, cultured cells
were exposed to hyperosmotic stress in the presence or absence of rosiglitazone or
gemfobrozil, and viability was measured. Hyperosmotic stress induced a rapid
decrease in cardiomyocyte viability. Cardiomyocyte death was also achieved by simulated ischemia/reperfusiom. Neither rosiglitazone nor gemfibrozil prevented
cardiomyocyte death induced by both procedures. Hyperosmotic stress-induced cell
death was characterized as apoptosis, as determined by mitochondrial potential decay
and DNA fragmentation visualized by sub G1 population in propidium iodide-treated
cells followed flow cytometry. Both rosiglitazone and gemfibrozil did not prevent the
hyperosmotic stress-induced apoptosis.
Finally, these results allow us to conclude that rosiglitazone induces
cardiomyocyte autophagy but this process does not affect cardiomyocyte viability
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105221 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Valenzuela Bassi, Rodrigo Andrés |
| Contributors | Lavandero González, Sergio, Bronfman Aguiló, Miguel, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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