Submitted by Priscila Nascimento (priscila.nascimento@bio.fiocruz.br) on 2016-04-11T17:27:57Z
No. of bitstreams: 1
Dissertação de Mestrado em Oncologia - INCa Ana Emília Goulart.pdf: 3332973 bytes, checksum: abe7cedda85b0558a252f168374ab1f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Priscila Nascimento (priscila.nascimento@bio.fiocruz.br) on 2016-04-11T17:28:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1
Dissertação de Mestrado em Oncologia - INCa Ana Emília Goulart.pdf: 3332973 bytes, checksum: abe7cedda85b0558a252f168374ab1f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T17:28:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Dissertação de Mestrado em Oncologia - INCa Ana Emília Goulart.pdf: 3332973 bytes, checksum: abe7cedda85b0558a252f168374ab1f4 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Tecnológico em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Introdução: O PCA3 é um RNA não codificante (ncRNA), expresso especificamente
na próstata, estando envolvido no controle da sobrevivência de células de carcinoma
de próstata (CaP), através da via de sinalização do receptor de androgênio (AR).
Objetivo: Investigar se diversos genes relacionados ao câncer – incluindo os
envolvidos na Transição Epitelial Mesenquimal (EMT), os que apresentam potencial
stemness e os co-reguladores do AR – podem estar envolvidos no processo de
resposta ao silenciamento do PCA3. Além disso, objetivamos promover o
silenciamento estável do PCA3 através da construção de um vetor lentiviral
carreando short hairpin RNA (shRNA) específico para este ncRNA, vislumbrando
estratégias terapêuticas para o CaP. Metodologia: Empregamos small interfering
RNA (siRNA) ou shRNA com expressão baseada em vetores lentivirais para diminuir
a expressão de PCA3 em células LNCaP e avaliar os efeitos deste silenciamento na
sobrevivência destas células. Para isto, analisamos por qRT-PCR a expressão do
PCA3 e de diversos genes relacionados ao câncer. Utilizamos microscopia confocal
para analisar a expressão da proteína vimentina. Empregamos citometria de fluxo
para verificar o percentual de células LNCaP GFP+ e, azul de tripan para avaliar o
número de células viáveis, após o silenciamento estável do PCA3. Resultados:
Dentre os co-reguladores do AR, ARA 70, ARA 54, Smad3 e EBP1 apresentaram
expressão aumentada nas células LNCaP interferidas com siPCA3 em relação às
células LNCaP interferidas com siScrbl, enquanto Smad 4 e ciclina D1 apresentaram
expressão diminuída. Dentre 84 genes relacionados ao câncer, 16 apresentaram
expressão alterada em células LNCaP- siPCA3 em relação ao controle. Destes, 30%
codificam moléculas de transdução de sinais e fatores de transcrição. Observou-se
expressão aumentada de E-caderina, Claudina-3, Citoqueratina-18, Snail, Twist e
Slug em células LNCaP -siPCA3 em relação ao controle, enquanto observou-se
expressão diminuída de Claudina-4, Citoqueratina-8 e Vimentina. O padrão de
marcação de vimentina foi similar em células LNCaP – siPCA3 e células LNCaP –
siScrbl. Não foi detectada a expressão de genes com potencial stemness nas
condições testadas. Células transduzidas com vetores lentivirais carreando shPCA3
apresentaram diminuição estável da expressão do PCA3. Foi observada redução
estável de cerca de 60% de células LNCaP GFP+ transduzidas com shPCA3, além
de redução no número de células viáveis. Conclusão: O silenciamento do PCA3
reduz o número de células viáveis, através de um processo que envolve moléculas
de transdução de sinais e fatores de transcrição que podem orquestrar a
sobrevivência das células de CaP. A diminuição no número de células viáveis após a
transfecção com siPCA3 parece não ser modulada pelo programa EMT clássico,
embora a reversão parcial deste programa possa estar regulando a diminuição da
sobrevivência celular induzida por siPCA3. A desregulação da expressão de coreguladores
do AR observada pode estar envolvida na inibição da expressão dos
genes alvo do AR. Nossos dados sugerem que este ncRNA desempenha papel
regulador na transcrição gênica, sendo capaz de modular a expressão de genes de
diversas vias de sinalização relacionadas ao câncer. Nossos resultados sugerem
ainda que a redução estável do PCA3 apresenta potencial aplicação em estratégia
terapêuticas que visem modular negativamente a sobrevivência das células de CaP. / Introduction: PCA3 is a prostate specific non coding RNA (ncRNA), involved in the
control of prostate cancer (PCa) cell survival, through modulating androgen receptor
(AR) signaling. Objective: In order to better characterize the molecular mechanisms
by which PCA3 is controlling LNCaP cell survival, we aimed to investigate whether
several cancer related genes, including those involved in epithelial-mesenchymal
transition (EMT), stemness potential and AR co-regulators could be involved in this
process in response to PCA3 downregulation. Moreover, we aimed to promote PCA3
stable silencing through a lentiviral vector containing a PCA3 short hairpin RNA
(shRNA) specific sequence. Methodology: We used small interfering RNA (siRNA)
or lentivirus vectorbased shRNA to downregulate PCA3 expression and evaluate the
effects of this ncRNA knockdown on LNCaP cell survival. After PCA3
downregulation, cells were analyzed by qRT-PCR to investigate PCA3 and several
cancer related genes expression. Confocal microscopy was performed to analyze
vimentin expression. Flow cytometry was performed to analyze the percentage of
LNCaP GFP positive cells and trypan blue staining to analyse the number of viable
cells after PCA3 stable silencing. Results: Among AR co-regulators genes
investigated, ARA70, ARA54, Smad 3 and EBP1 were upregulated in siPCA3-
transfected cells in relation to scramble sequence LNCaP transfected cells, while
Smad 4 and cyclin D1 were downregulated. We found that among 84 cancer-related
genes tested, 16 were differentially expressed in LNCaP siPCA3-transfected cells
when compared to transfected cells with a scramble sequence. Of these, 30% are
genes coding for signal transduction molecules and transcription factors. Gene
expression profile of EMT-related genes revealed that E-cadherin, Claudin-3,
Cytokeratin-18, Snail, Twist and Slug are upregulated in LNCaP siPCA3-transfected
cells compared to control, while Claudin-4, Cytokeratin-8 and Vimentin are
downregulated. Vimentin expression staining patterns were similar between LNCaP
siPCA3-transfect cells and control. Expression of stemness markers were not
detected in these tested conditions. LNCaP cells transduced with lentiviral vectors
carrying the GFP gene and shPCA3 stably dowregulated PCA3 expression,
producing a reduction of 60% of LNCaP GFP+ cells compared to shScrbl transduced
or non-transduced LNCaP cells. In addition, the number of viable cells was reduced
after PCA3 stable silencing. Conclusion: PCA3 downregulation by RNAi leads to a
loss of viability, through a process that involves key signal transduction molecules
and transcription factors that could orchestrate PCa cells survival. Our results also
suggested that the decrease in the number of LNCaP viable cells, observed after
siPCA3 transfection, seems to don´t be modulated by the classical EMT program,
although a partial reversion of this program could regulate the reduction of cell
survival induced by siPCA3. Observed deregulated expression of AR co-regulators
could be involved in the inhibition of the AR target genes expression. Our data
suggest that that this ncRNA perform a regulatory role in gene expression, being able
to modulate gene expression of several signaling pathways related to cancer.
Moreover, our results suggest that the stable downregulation of PCA3 expression
shows potential as a PCa therapeutic approach by negatively modulation cell
survival.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13674 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Goulart, Ana Emília |
| Contributors | Díaz, José Andrés Morgado, Nasciutti, Luiz Eurico, Homma, Akira, Sá, Mariana Emerenciano Cavalcanti de, Freire, Marcos da Silva, Bonamino, Martin Hernan, Gimba, Etel Rodrigues Pereira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0021 seconds