O Brasil é o maior produtor mundial de feijão com produção média anual de 3,5 milhões de toneladas, entretanto, um dos maiores problemas enfrentados por essa cultura é o déficit hídrico, que leva a uma redução considerável em seu rendimento. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água durante o seu desenvolvimento é de grande utilidade. E, como a tolerância à seca é um caráter multigênico, genótipos com diferentes graus de tolerância apresentam expressão gênica diferencial, com ativação e/ou repressão de determinados genes. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos: (i) identificar genes diferencialmente expressos em dois genótipos de feijoeiro comum, sendo um tolerante (BAT 477) e o outro suscetível (IACCarioca 80SH) à seca; (ii) verificar a expressão gênica espacial (em raízes, caules e folhas) e temporal (cinco níveis crescentes de déficit hídrico - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h de exposição ao estresse) por meio de RT-qPCR; (iii) predizer a função dos genes identificados, com base nos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, usando dados públicos de microarranjo disponíveis na plataforma Genevestigator. Para atingir esses objetivos, foi conduzido um experimento em casa-de-vegetação, sendo induzido o déficit hídrico, por meio da suspensão da irrigação, quando as plantas atingiram o estádio fenológico R5, mantendo sob suprimento hídrico adequado as plantas-controle. Foi então utilizada a técnica de cDNA-AFLP para isolar os transcritos diferencialmente expressos entre os dois genótipos, sob seca, a qual aliada ao sequenciamento possibilitou a identificação e anotação de 45 transcritos, sendo 21 exclusivamente expressos no genótipo tolerante e 24 no genótipo suscetível. Dentre os transcritos identificados no genótipo tolerante, podem ser listados pelo menos 11, com potencial de serem usados para transformação genética (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related e TCP transcription factor), e no genótipo suscetível, podem ser listados nove (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin e SWI/SNF-related chromatin binding). Na análise de expressão gênica espacial e temporal, os transcritos mais promissores para uso em trabalhos futuros de transformação genética foram: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase e HSP 70 protein, uma vez que tiveram uma expressão bastante pronunciada no genótipo tolerante. Através das análises in silico, baseadas nos genes ortólogos de A. thaliana, foram descobertos processos e vias metabólicas que podem estar envolvidos na resposta do feijoeiro comum ao déficit hídrico. Além disso, foram identificados genes associados com a tolerância à seca, corroborando os dados experimentais. Sendo assim, os resultados obtidos nesse trabalho fornecem o entendimento necessário ao desenvolvimento de ferramentas moleculares (marcadores para genes diferencialmente regulados) para serem utilizados em programas de melhoramento, bem como para informação genética básica na anotação funcional do genoma do feijoeiro e também para utilização desses genes candidatos em trabalhos de transformação genética para obtenção de plantas mais tolerantes à seca. / Brazil is the largest producer of common beans, with average annual production of 3.5 million tonnes; however, one of the biggest problems faced by this crop is drought, which leads to a considerable reduction in their yield. Thus, the identification of genes that control the defense mechanisms and adaptation of common bean to drought during its development is very useful. Drought tolerance is a multigenic character, so genotypes with different degrees of water deficit tolerance exhibit differential gene expression, with activation and/or repression of certain genes. Therefore, this study aimed to: (i) identify differentially expressed genes in two common bean genotypes, one tolerant (BAT 477) and other susceptible (IAC-Carioca 80SH) to drought, (ii) verify the spatial (root, stem and leaves) and temporal (five increasing levels of water deficit - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h of stress exposition) gene expression by RTqPCR (iii) predict the genes function, based on Arabidopsis thaliana orthologous genes, using available data in the public microarray platform Genevestigator. To achieve these objectives, an experiment was conducted in a green house, being induced water deficit, by withholding water when the plants reached growth stage R5, maintaining adequate water supply under the control plants. To isolate transcripts differentially expressed between the two genotypes under drought was used the cDNA-AFLP technique, which coupled with sequencing enabled the identification and annotation of 45 transcripts, 21 exclusively expressed in the tolerant genotype and 24 in the susceptible one. Among the transcripts identified in the tolerant genotype, may be listed at least 11, with potential to be used in genetic transformation (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related and TCP transcription factor), and in the susceptible genotype, can be listed nine (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin and SWI/SNF-related chromatin binding). In the spatial and temporal gene expression analysis, the transcripts that stood out for use in genetic transformation future studies were: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase and HSP 70 protein, since it had an expression quite pronounced in the tolerant genotype. Through the in silico analysis, based on orthologous genes of A. thaliana, was discovered processes and metabolic pathways that may be involved in the common bean response to drought. In addition, we identified genes associated with drought tolerance, corroborating the experimental data. Thus, the present results provide the necessary understanding to develop molecular tools (markers for differentially regulated genes) to be used in breeding programs, as well as basic genetic information in the common bean functional genome annotation and also to use these candidate genes for genetic transformation to obtain drought-tolerant plants.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03092013-141700 |
| Date | 04 June 2013 |
| Creators | Biazuzo, Milena Moura de Araujo |
| Contributors | Mui, Tsai Siu |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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