Papilomavírus humanos (HPVs) são vírus de DNA que infectam células epiteliais, podendo ser responsáveis pelo aparecimento de lesões benignas e malignas. Dentre os mais de 120 tipos identificados, o HPV -16 constitui o principal agente etiológico do câncer cervical, que é uma das maiores causas de morte por câncer em mulheres no mundo. Sendo assim, infecções associadas ao HPV devem ser prevenidas por vacinas indutoras de resposta imune vírus-específicas. A proteína L1 do capsídio viral é capaz de arranjar-se em partículas morfologicamente e antigenicamente semelhantes ao vírus, denominadas \"virus-like particles\" (VLPs), que induzem altos títulos de anticorpos neutralizantes. Neste trabalho, foram clonados os genes L1 selvagem e otimizado de HPV -16 em vetores de expressão de leveduras metilotróficas como Hansenula polymorpha e Pichia pastoris. Foi observada uma expressão consistente da proteína recombinante apenas em P. pastoris, com o gene L1 otimizado. Foram realizadas diversas tentativas de purificação da proteína heteróloga, empregando técnicas de cromatografia e ultracentrifugação em gradiente descontínuo de sacarose. A correta montagem das VLPs foi confirmada por microscopia eletrônica. Problemas de agregação, heterogeneidade e adsorção a superfícies apresentados pela proteína L1 foram resolvidos após utilização de surfactante não-iônico e de um procedimento de desmontagem e remontagem das partículas, gerando preparações mais homogêneas. Ensaios de hemaglutinação e inibição da hemaglutinação comprovaram a apresentação de epítopos conformacionais na superfície das VLPs. Este trabalho demonstrou pela primeira vez a expressão da proteína L1 de HPV -16 em P. pastoris, visando ao desenvolvimento de uma vacina profilática de baixo custo para o sistema público de saúde. / Human papillomaviruses (HPVs) are DNA viruses that infect epithelial cells and can cause both benign and malignant lesions. From over 120 types catalogued so far, HPV-16 is the main etiologic agent of cervical cancer, which is the one of the most common causes of cancer deaths among women worldwide. Thus, HPV -associated infections might be prevented by vaccine inducing virus-specific immune responses. The L1 major capsid protein can self assemble into virus-like particles (VLPs), which are morphologically and antigenically indistinguishable from native viruses and induce high titers of neutralizing antibodies. In this work, we have cloned wild-type and codon-optimized L1 genes from HPV-16 in expression vectors of the methylotrophic yeasts Hansenula polymorpha and Pichia pastoris. Consistent L1 expression was only observed in P. pastoris transformed with the construction containing the codon-optimized gene. Many attempts to purify the heterologous protein were made, including chromatography and ultracentrifugation in sucrose density gradients. The correct assembly of VLPs was confirmed by electron microscopy. Some problems presented by recombinant L1 like aggregation, surface adsorption and heterogeneity were solved by using non-ionic surfactants and a procedure of disassembly and reassembly of the particles. Hemagglutination and hemagglutination inhibition assays corroborated the display of surface conformational epitopes by VLPs. This work showed for the first time the expression of the HPV-16 L1 protein in P. pastoris, aiming the development of a prophylactic vaccine free of charge for the public health system in Brazil.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18102007-171459 |
| Date | 20 August 2007 |
| Creators | Bazan, Silvia Boschi |
| Contributors | Ho, Paulo Lee |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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