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Previous issue date: 2016-02-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O crescimento e o desenvolvimento vegetal são controlados por uma complexa rede metabólica controlada por fatores ambientais, incluindo a disponibilidade de água, nutrientes e luz, e por várias vias de sinalização. Uma das mais importantes vistas de sinalização, conservada em eucariotos, é a kinase Target of Rapamycin (TOR). Várias linhas de evidência demonstram que TOR exerce um papel fundamental no balanço de carbono e nitrogênio, agindo como um regulador essencial do metabolismo central, controlando o crescimento e a produção de biomassa. O amido é a principal forma de armazenamento de carbono e seu conteúdo é correlacionado negativamente com crescimento. Linhas transgênicas com expressão reduzida do gene TOR ou dos componentes do complexo apresentam um claro fenótipo de acúmulo de amido. No entanto, ainda não é elucidado se o acúmulo de amido é devido a um aumento na síntese, decréscimo na degradação ou ambos. Neste trabalho, plântulas de Arabidopsis tratadas com o inibidor químico específico de TOR AZD-8055, que age no sítio de ligação do ATP no domínio quinase de TOR, mostraram um fenótipo de acúmulo de amido logo após 4 horas de tratamento e este acúmulo é devido a um aumento nas taxas de síntese deste polímero. Além disso, plântulas onde TOR estava inibida apresentaram um aumento em torno de 30-40% em seu conteúdo de amido em comparação ao controle. Análise de perfil metabólico em plântulas com inibição de TOR apresentaram mudanças nos níveis de sacarose, frutose, glicose, maltose, manose e fosfato inorgânico. Todos estes metabólitos estão correlacionados direta ou indiretamente com o metabolismo de amido. Uma correlação entre o teor de manose, fosfato inorgânico e aumento de amido foi notável em plantas tratadas com AZD-8055. Análise de expressão gênica de subunidades da AGPase apresentou mudanças significativas nos pontos 18 e 24 horas após o tratamento com o inibidor. Atividade catalítica máxima da AGPase foi determinada nos pontos 2, 4, 6, 10 e 24 horas após a administração de AZD-8055. No entanto, a atividade só foi estatisticamente diferente entre tratamentos nos pontos 4 e 24 horas. Immunoblotting para esta enzima mostrou que após 4 horas de inibição da via TOR, o conteúdo de AGPase em sua forma dimérica tendeu a ser maior em plantas controle. Além disso, o teor total de AGPase e seu conteúdo na forma monomérica foram maiores em plantas tratadas com AZD-8055 após 6 horas de tratamento na luz. Sabendo que várias enzimas relacionadas ao metabolismo do amido são reguladas pelo potencial redox da célula, os níveis de glutationa foram mensurados para verificar o potencial redox celular. Plantas tratadas com AZD-8055 apresentaram mudanças na quantidade total de glutationa, pincipalmente na sua forma reduzida e o potencial redox da célula tendeu a ficar mais reduzido. Em conjunto, estes resultados indicam a participação de TOR no metabolismo do amido, mas o exato mecanismo por trás disso ainda está longe de ser elucidado. / Plant growth and development are maintained by a complex network controlled by environmental factors including the availability of water, light and nutrients and by several signaling pathways. One of the most important signaling pathways, conserved in eukaryotes, is the kinase Target of Rapamycin (TOR). Various lines of evidence point out that TOR plays a fundamental role in carbon and nitrogen balance, acting as an essential regulator on central metabolism by controlling growth and biomass production. Starch is the major form of carbon storage and its content is negatively correlated with growth. Transgenic lines with reduced expression of TOR gene or components of the TOR complex present a clear starch excess phenotype. However, it remained to be elucidated whether the accumulation of starch is due to increased synthesis, impaired degradation or both. In this work, Arabidopsis seedlings treated with the specific ATP-competitive inhibitor of TOR kinase AZD-8055 showed a starch excess phenotype right after 4 hours of treatment and the accumulation of starch was proved to be due to an augmentation in the rate of starch synthesis. Furthermore, TOR- inhibited plants presented an average increase of 20-30% in their starch content at the end of day when compared to control. Metabolite profiling analysis showed that TOR– inhibited plants exhibited broad changes in the levels of sucrose, fructose, glucose, maltose, mannose and orthophosphate, which are associated directly or indirectly with starch metabolism. In addition, a correlation between the amount of mannose, orthophosphate and increased starch content was noticed in AZD-treated plants. Gene expression analysis of AGPase subunits showed significant changes only from 18 and 24h after treatment. Although TOR inhibited plants displayed higher content of the active form of AGPase (monomer), enzymatic activity assays revealed that changes in AGPase activity might occur as secondary effect of TOR inhibition and might be not related to the starch excess phenotype observed 4 hours after AZD-treament. Since several enzymes related to starch metabolism are subject to redox regulation, the levels of glutathione were measured to verify the redox environment of the cells. TOR- inhibited plants showed changes in the pools of glutathione, mainly in its reduced form, and the redox state of the cells tended to be more reduced. Together, these results indicate the participation of TOR signalling on starch metabolism but the mechanistic behind this process need further studies.
Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/11600 |
Date | 22 February 2016 |
Creators | Araujo, Elias Feitosa |
Contributors | Caldana, Camila |
Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
Language | English |
Detected Language | Portuguese |
Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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