In allen Retroviren, mit Ausnahme der Foamyviren (FV), wird das Pol-Protein als Gag-Pol-Fusionsprotein exprimiert. Dieser Mechanismus sichert die Inkorporation von Pol in das virale Partikel. FV unterscheiden sich in vielen Merkmalen von den Orthoretroviren, unter anderem wird das Pol-Protein von einer eigenen gespleißten mRNA translatiert. Diese von Gag unabhängige Expression führt zu der Frage nach dem Mechanismus der Pol-Inkorporation in foamyvirale Partikel. Unter Nutzung eines transienten FV-Vektor Transfektionssystems, das auf der Kotransfektion von vier separaten Expressionseinheiten zur Produktion von Gag, Pol, Env und einer Vektor-RNA beruht, konnte gezeigt werden, daß (prä)genomische RNA für die effiziente Partikelinkorporation von Pol notwendig ist. Protein-Protein-Interaktionen zwischen Pol und Gag sind deshalb nicht ausreichend für die Bildung vollständiger Viruspartikel. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob es möglich ist spezifische Sequenzen in der Virus-RNA zu identifizieren, die für die Inkorporation des Pol-Proteins essentiell sind. Empririsch wurden bereits zwei cis-aktive Sequenzen (CAS) identifiziert, die, zusammen mit den long terminal repeats (LTR) und benachbarten Sequenzen für die reverse Transkription und Integration, ausreichend für effizienten FV-Vektortransfer sind. Daher müssen RNA-Elemente, die für die Verpackung des Pol-Proteins nötig sind, in diesen beiden CAS liegen. Durch das Einführen von Deletionen und anschließender Analyse der Proteinzusammensetzung und des RNA-Gehaltes von Viruspartikeln, wurden die für die Pol-Inkorporation essentiellen RNA-Sequenzen identifiziert. In dieser Arbeit konnten zwei RNA-Sequenzelemente definiert werden, die für die Partikelinkorporation des Pol-Proteins notwendig sind, diese wurden PES (Pol encapsidation sequences) genannt. Keines der beiden Sequenzelemente hat einen signifikanten Einfluß auf die Verpackung der Vektor-RNA, wohingegen bereits die Deletion einer der PES zu einer signifikanten Reduktion der Pol-Verpackung führt. Eine PES, die möglicherweise nur 30 nt umfaßt, liegt unmittelbar 5’ der PBS (Nukleotide 318-345, relativ zu PFV Transkriptionsstart) und die zweite PES mit einer wahrscheinlichen Länge von 370 nt liegt in der 3’ Region des pol-Gens (Nukleotide 4980-5351). Diese Ergebnisse führen zu einem Model, in dem die (prä)genomische RNA von FV als eine Art Brückenmolekül zwischen Gag und Pol fungiert. Die RNA interagiert auf der einen Seite über die PES mit Pol und auf der anderen Seite mit Gag über die GRI-Box im carboxyterminalen Bereich des Proteins und vermittelt so die Inkorporation des Pol-Proteins in das Gag-Kapsid. Weiterhin wurden die Voraussetzungen auf Proteinebene für die Verpackung des Pol-Proteins untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß nur das Pol-Vorläuferprotein und weder die einzelne Reverse Transkriptase- noch die Integrase-Untereinheit in das foamyvirale Partikel verpackt wird. Die enzymatischen Aktivitäten der Protease, der Reversen Transkriptase oder der Integrase des Pol-Proteins sind für die Verpackung jedoch nicht essentiell. / In all retroviruses with the exception of foamy virus (FV), the Pol protein is expressed as a Gag-Pol precursor, which facilitates Pol incorporation into the viral particle. FVs diverge from orthoretroviruses in many ways. One of it is that the Pol protein is translated from a spliced mRNA independently of Gag. This method of expression raises the question of the mechanism of Pol incorporation into the viral particle. Using a transient FV vector transfection system based on cotransfection of four separate expression units to generate Gag, Pol, Env, and a vector RNA, it is shown that (pre)genomic RNA is required for efficient virion incorporation of Pol. Thus, protein-protein interactions of Pol with Gag are not sufficient to complete particle assembly. It is further investigated whether specific sequences on the RNA which allow for Pol protein incorporation can be identified. Two empirically identified cis-acting sequences (CAS) are, together with the long terminal repeats (LTR) and adjacent sequences required for reverse transcription and integration, sufficient to allow efficient FV vector transfer. Thus, any RNA element required for Pol protein encapsidation must be confined to these two CAS. By introducing deletions into the CAS elements and analyzing the protein compositions and RNA contents of FV particles, the RNA sequence elements required for Pol protein incorporation were identified. It is demonstrated that two distinct sequences in the RNA, which were termed Pol encapsidation sequences (PES), are required to incorporate Pol protein into the FV capsid. Neither element has any significant effect on RNA packaging. However, deletion of either PES resulted in a significant reduction in Pol encapsidation. One PES, which can be as short as 30 nt, is located just 5’ to the PBS (nucleotides 318-345 relative to PFV start of transcription) and another PES of probably 370 nt is located in the 3’ Region of the pol gen (nucleotides 4980-5351). These results lead to a model in which the (pre)genomic RNA serves as a bridging molecule for the interaction of Pol with Gag. On the one hand the RNA interacts with Pol via the PES and on the other hand with Gag via the GRI box in the carboxy terminus of Gag. This way RNA mediates encapsidation of Pol into the viral particle. Furthermore, the requirements on the protein level for encapsidating Pol protein were investigated. It is shown that only the Pol precursor, but not the individual reverse transcriptase or integrase subunits, is incorporated into FV particles. However, the enzymatic activities of the FV Pol protein are not required for encapsidation, at least as far as protease, reverse transcriptase, and integrase activities are concerned.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1525 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Peters, Katrin |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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