Würzburg, Universiẗat, Diss., 2000. / Dateien im PDF-Format.

Universiẗat, Diss., 2006--Würzburg.

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Dresden.

Die Foamyviren nehmen aufgrund verschiedener Charakteristika ihrer Replikationsstrategie eine Sonderstellung innerhalb der Retroviren ein. Aufgrund dieser Besonderheiten, wie zum Beispiel der viralen Genexpression oder dem Zeitpunkt ihrer reversen Transkription im Replikationszyklus, werden sie einer eigenen Subfamilie zugeordnet, den Spumaviren. Funktionell zählen sie zu den komplexen Retroviren, da sie neben dem minimalen Gensatz der einfachen Retroviren Gag, Pol und Env noch zwei weitere akzessorische Leserahmen aufweisen. Einer der Leserahmen kodiert für Tas, einem transkriptionellen Transaktivator, der für die Replikation der Foamyviren notwendig ist. In dieser Arbeit sollte ein infektiöser Klon, mit konstitutiv aktivem Promotor durch genetische Vereinfachung des prototypischen Foamy Virus (PFV) konstruiert werden. Dieser Klon trägt den Promotor eines einfachen Retrovirus, des Spleen Focus Forming Virus, im Kontext einer hybriden LTR. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Konstrukt, sowie ein weiteres mit funktionaler Deletion des Tas-Gens, in transfizierten Zellkulturen zur Freisetzung genetisch vereinfachter, infektiöser Viren führte. Weiterhin konnte ihre Replikationskompetenz und genetische Stabilität nachgewiesen werden. Diese Vektorkonstrukte hatten im Vergleich zu genetisch vereinfachten Vorkonstrukten mit konstitutiv aktiven immediate early gene (IE) Promotor und Enhancer des Cytomegalievirus (CMV) eine verbesserte Replikationskinetik. Gegenüber den Wildtypvarianten zeigten die rekombinanten Viren mit SFFV-Promotor jedoch eine verzögerte Replikationskinetik, sowie erniedrigte Virustiter im zellfreien Kulturüberstand. In der Weiterführung der Arbeit sollte die genetische Vereinfachung mit SFFV-Promotor an einem bestehenden replikationsinkompetenten PFV-Vektorsystem angewendet werden. Die dadurch erreichte Verringerung der foamyviralen Sequenzen und daraus entstehende Reduktion homologer Sequenzen sollte einen weiteren Sicherheitsaspekt darstellen. Durch die Vektorkonstruktion ergab sich weiterhin eine Erhöhung des Verpackungslimits auf fast 9Kb. Mit dem neuen Vektorkonstrukt konnte jedoch gegenüber den Vorkonstrukten nur eine geringe Transduktionseffizienz erreicht werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass eine genetische Vereinfachung von PFV und seine Replikation mit einem heterologen Promotor in einer hybriden LTR möglich ist. Damit ist eine Voraussetzung für die Konstruktion PFV-basierter Vektoren zur Gentherapie unter Verwendung gewebespezifischer Promotoren gegeben. / To evaluate the possibility of generating viruses and vectors that combine the features of orthoretroviruses and foamy viruses (FV) we constructed viruses and vectors with a FV backbone and hybrid long terminal repeats (LTRs). The enhancer and promoter elements of the gammaretrovirus spleen focus forming virus (SFFV) were inserted into the U3 region in place of the transcriptional transactivator-dependent FV elements. Viruses and vectors were able to either replicate or transduce and express a transgene, respectively. However, monitoring revealed very low efficiencies in both cases. For hybrid LTR constructions we detected no advantage of orthoretroviral elements over herpesviral promoter and enhancer elements that were used previously to generate similar recombinants.

Foamyviren (FV) sind komplexe Retroviren, die sich in ihrem Replikationszyklus in vielerlei Hinsicht von den klassischen Retroviren (Orthoretrovirinae) unterscheiden. Funktional nehmen sie eine Mittelstellung zwischen Orthoretroviren und Hepadnaviren ein. Wichtige Unterschiede zu Orthoretroviren liegen in der Reifung und Ausschleusung viraler Partikel. Die Partikelreifung findet wie bei Typ B/D-Orthoretroviren an intrazytoplasmatischen Strukturen statt. Die Partikelfreisetzung wurde bei FV im Gegensatz zu Orthoretroviren hauptsächlich als Ausknospen an intrazellulären Membranen beschrieben. Neben anderen für das Ausknospen relevanten Motiven wurde im viralen Glykoprotein ein ER-Rückführungsmotiv gefunden, das in fast allen FV vorhanden ist und die Ausschleusung an intrazytoplasmatische Membranen dirigieren soll. Im Jahr 2000 wurde erstmals ein FV aus Pferden isoliert. Dieses Equine Foamy Virus (EFV) zeigte die beschriebenen Eigenschaften anderer FV, jedoch ein ausschließliches Ausknospen viraler Partikel an der Plasmamembran. Ein ER-Rückführungsmotiv ist im Genom von EFV nicht konserviert. In dieser Arbeit wurde aus mit EFV infizierten Zellkulturen mit Hilfe der PCR das virale Genom amplifiziert und kloniert. Die Genomanteile wurden zu einem proviralen molekularen Klon des Virus zusammengefügt. Eine vollständige Sequenzierung erlaubte die Identifikation expressionskritischer Veränderungen. Mittels weiterer Klonierungen und PCR-Mutagenese konnten eine Sequenzunterbrechung und verschiedene Stopp-Mutationen korrigiert werden. Verschiedene Zelllinien wurden mit dem proviralen Klon transfiziert, eine quantitativ relevante Anzucht von Viren in der Zellkultur gelang trotz Nachweis von viralem Genom durch PCR nach mehreren zellfreien Passagen nicht. Als Ursache der fehlenden Virusexpression sind Mutationen des Matrizengenoms vor der Klonierung zu vermuten, die für die effektive Replikation relevante, aber bisher noch nicht bekannte Positionen in regulatorischen Proteinen oder LTR-Regionen betreffen. / Foamy viruses are complex retroviruses, which differ from classic retroviruses in many aspects of their replication cycle. Their characteristics are between orthoretroviruses and hepadnaviruses. Important differences to orthoretroviruses concern particle maturation and budding. Particle maturation takes place at intracytoplasmatic structures like with type B/D retroviruses. Particle release in foamy viruses was described as budding from intracellular membranes in opposite to orthoretroviruses budding from plasma membrane. Besides other relevant budding motives an ER retrieval motif was found in almost all foamy viral glykoproteins which is supposed to direct particle budding to intracytoplasmatic membranes. In 2000 a foamy virus was isolated from horses. This equine foamy virus (EFV) showed the usual foamy viral characteristics, but an exclusive budding of viral particles from plasma membrane. An ER retrieval motif is mot conserved among EFV. For this study the viral genome was amplified from EFV-infected cell cultures by PCR and cloned. The genome parts were put together to a proviral molecular clone of EFV. Complete sequencing allowed identification of critical changes in comparison to the published sequence. A disruption of the sequence and several stop mutations could be corrected by subsequent cloning and PCR mutagenesis. Several adherent cell lines were transfected with the proviral clone, a quantitatively relevant culture of the virus was not achieved despite proof of viral genome by PCR after several cell-free passages. As a cause for the lack of expression has to be thought of mutations of the template genome before cloning. Those mutations may affect yet unknown positions in regulatory proteins or LTR regions relevant for effective replication.

In allen Retroviren, mit Ausnahme der Foamyviren (FV), wird das Pol-Protein als Gag-Pol-Fusionsprotein exprimiert. Dieser Mechanismus sichert die Inkorporation von Pol in das virale Partikel. FV unterscheiden sich in vielen Merkmalen von den Orthoretroviren, unter anderem wird das Pol-Protein von einer eigenen gespleißten mRNA translatiert. Diese von Gag unabhängige Expression führt zu der Frage nach dem Mechanismus der Pol-Inkorporation in foamyvirale Partikel. Unter Nutzung eines transienten FV-Vektor Transfektionssystems, das auf der Kotransfektion von vier separaten Expressionseinheiten zur Produktion von Gag, Pol, Env und einer Vektor-RNA beruht, konnte gezeigt werden, daß (prä)genomische RNA für die effiziente Partikelinkorporation von Pol notwendig ist. Protein-Protein-Interaktionen zwischen Pol und Gag sind deshalb nicht ausreichend für die Bildung vollständiger Viruspartikel. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob es möglich ist spezifische Sequenzen in der Virus-RNA zu identifizieren, die für die Inkorporation des Pol-Proteins essentiell sind. Empririsch wurden bereits zwei cis-aktive Sequenzen (CAS) identifiziert, die, zusammen mit den long terminal repeats (LTR) und benachbarten Sequenzen für die reverse Transkription und Integration, ausreichend für effizienten FV-Vektortransfer sind. Daher müssen RNA-Elemente, die für die Verpackung des Pol-Proteins nötig sind, in diesen beiden CAS liegen. Durch das Einführen von Deletionen und anschließender Analyse der Proteinzusammensetzung und des RNA-Gehaltes von Viruspartikeln, wurden die für die Pol-Inkorporation essentiellen RNA-Sequenzen identifiziert. In dieser Arbeit konnten zwei RNA-Sequenzelemente definiert werden, die für die Partikelinkorporation des Pol-Proteins notwendig sind, diese wurden PES (Pol encapsidation sequences) genannt. Keines der beiden Sequenzelemente hat einen signifikanten Einfluß auf die Verpackung der Vektor-RNA, wohingegen bereits die Deletion einer der PES zu einer signifikanten Reduktion der Pol-Verpackung führt. Eine PES, die möglicherweise nur 30 nt umfaßt, liegt unmittelbar 5’ der PBS (Nukleotide 318-345, relativ zu PFV Transkriptionsstart) und die zweite PES mit einer wahrscheinlichen Länge von 370 nt liegt in der 3’ Region des pol-Gens (Nukleotide 4980-5351). Diese Ergebnisse führen zu einem Model, in dem die (prä)genomische RNA von FV als eine Art Brückenmolekül zwischen Gag und Pol fungiert. Die RNA interagiert auf der einen Seite über die PES mit Pol und auf der anderen Seite mit Gag über die GRI-Box im carboxyterminalen Bereich des Proteins und vermittelt so die Inkorporation des Pol-Proteins in das Gag-Kapsid. Weiterhin wurden die Voraussetzungen auf Proteinebene für die Verpackung des Pol-Proteins untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß nur das Pol-Vorläuferprotein und weder die einzelne Reverse Transkriptase- noch die Integrase-Untereinheit in das foamyvirale Partikel verpackt wird. Die enzymatischen Aktivitäten der Protease, der Reversen Transkriptase oder der Integrase des Pol-Proteins sind für die Verpackung jedoch nicht essentiell. / In all retroviruses with the exception of foamy virus (FV), the Pol protein is expressed as a Gag-Pol precursor, which facilitates Pol incorporation into the viral particle. FVs diverge from orthoretroviruses in many ways. One of it is that the Pol protein is translated from a spliced mRNA independently of Gag. This method of expression raises the question of the mechanism of Pol incorporation into the viral particle. Using a transient FV vector transfection system based on cotransfection of four separate expression units to generate Gag, Pol, Env, and a vector RNA, it is shown that (pre)genomic RNA is required for efficient virion incorporation of Pol. Thus, protein-protein interactions of Pol with Gag are not sufficient to complete particle assembly. It is further investigated whether specific sequences on the RNA which allow for Pol protein incorporation can be identified. Two empirically identified cis-acting sequences (CAS) are, together with the long terminal repeats (LTR) and adjacent sequences required for reverse transcription and integration, sufficient to allow efficient FV vector transfer. Thus, any RNA element required for Pol protein encapsidation must be confined to these two CAS. By introducing deletions into the CAS elements and analyzing the protein compositions and RNA contents of FV particles, the RNA sequence elements required for Pol protein incorporation were identified. It is demonstrated that two distinct sequences in the RNA, which were termed Pol encapsidation sequences (PES), are required to incorporate Pol protein into the FV capsid. Neither element has any significant effect on RNA packaging. However, deletion of either PES resulted in a significant reduction in Pol encapsidation. One PES, which can be as short as 30 nt, is located just 5’ to the PBS (nucleotides 318-345 relative to PFV start of transcription) and another PES of probably 370 nt is located in the 3’ Region of the pol gen (nucleotides 4980-5351). These results lead to a model in which the (pre)genomic RNA serves as a bridging molecule for the interaction of Pol with Gag. On the one hand the RNA interacts with Pol via the PES and on the other hand with Gag via the GRI box in the carboxy terminus of Gag. This way RNA mediates encapsidation of Pol into the viral particle. Furthermore, the requirements on the protein level for encapsidating Pol protein were investigated. It is shown that only the Pol precursor, but not the individual reverse transcriptase or integrase subunits, is incorporated into FV particles. However, the enzymatic activities of the FV Pol protein are not required for encapsidation, at least as far as protease, reverse transcriptase, and integrase activities are concerned.

Würzburg, Univ., Diss., 2008

Bayreuth, Univ., Diss., 2009/2010.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2001.