Foamyviren (FV) weisen eine Reihe von Merkmalen auf, welche sie von Orthoretroviren unterscheidet, die sie jedoch gleichzeitig mit den Hepadnaviren teilen. Dies betrifft neben der Genomorganisation, der Proteinexpression sowie dem Replikationsverhalten auch die Partikelmorphogenese. Die zentrale Komponente in diesem Prozeß stellt das Gag-Protein dar. FV benötigen im Gegensatz zu Orthoretroviren und vergleichbar den Hepadnaviren die Koexpression des homologen Glykoproteins für den zellulären Partikelexport. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels eines chimären Konstruktes aus den Gag-Proteinen von MPMV und PFV versucht, ein Env-interagierendes Motiv sowie die für die Interaktion mit dem Glykoprotein essentiellen As in PFV Gag zu identifizieren. Dabei wiesen die chimären Gag-Proteine Gemeinsamkeiten mit PFV Gag auf, wie eine perinukleäre Akkumulation, eine Vorraussetzung für das Assembly sowohl von PFV als auch MPMV. Desweiteren waren die Gag-Chimären für einen zellulären Export auf die Koexpression des homologen Glykoproteins angewiesen. Dies deutete auf die Integrität und Funktionalität des dafür notwendigen PFV Gag N-Terminus hin. Die chimären Gag-Moleküle multimerisierten jedoch nicht zu Kapsiden oder vergleichbaren partikulären Strukturen, vermutlich aufgrund massiver sterischer Zwänge infolge der Beteiligung heterologer Proteindomänen, weswegen sie kein geeignetes System zur funktionellen Analyse der PFV Gag-Env-Interaktion darstellten. Eine weitere Besonderheit foamyviraler Gag-Proteine ist ihr äußerst geringer Lysinanteil. Im Gegensatz zu den Gag-Proteinen der Orthoretroviren wird der überwiegende Anteil basischer Aminosäuren (As) durch Arginin vertreten. Da über 60 % der Arginin-spezifizierenden Kodons über eine Einzelmutation aus Lysin-Kodons hervorgegangen sein könnten, ist es wahrscheinlich, daß im Verlauf der foamyviralen Evolution eine positive Selektionierung von Gag-Mutanten mit einer Lysin-zu-Arginin-Substitution stattfand. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde anhand der Beispiele von PFV sowie FFV der Frage nachgegangen, welche Funktionen Arginine in foamyviralen Gag-Proteinen während der Replikation übernehmen. Dazu wurde in infektiösen PFV- sowie FFV-Klonen eine Reihe von Argininen gegen Lysine substituiert. Zusätzlich wurde das singuläre Lysin in PFV Gag gegen Arginin substituiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß sämtliche PFV- sowie FFV-Mutanten replikationskompetent waren. Das singuläre Lysin in PFV Gag war für dessen Replikation in immortalisierten Zellen entbehrlich, in einer primären Zellinie wies die entsprechende Mutante jedoch eine stark eingeschränkte Replikationsfähigkeit auf. Eine PFV-Substitutionsmutante (M141) induzierte in transfizierten 293T-Zellkulturen einen CPE, ein Hinweis auf eine Beteiligung dieses Gag-Abschnittes an der Interaktion mit dem PFV Glykoprotein. Nach zehnmaliger Zellkultur-Passagierung der PFV Gag-Mutanten traten weder Revertanten noch Pseudorevertanten auf, was jedoch aufgrund der kurzen Zeitspanne des Experimentes nur eine begrenzte Aussagekraft bezüglich der genetischen Stabilität der Mutanten zuließ. Mittels der Applikation von AZT, eines Inhibitors der foamyviralen reversen Transkription, entweder auf die virusproduzierenden Zellen oder die zur Infektion verwendeten Zielzellen konnte gezeigt werden, daß sich die PFV Gag-Lysinmutanten hinsichtlich ihrer Replikationsstrategie nicht von WT-Viren unterscheiden und ihre genomische RNA größtenteils noch in der Produktionszelle revers transkribieren. Desweiteren konnte mittels quantitativer real-time PCR nachgewiesen werden, daß die PFV- und FFV-Mutanten wie für FV üblich sowohl DNA als auch RNA in ihre Partikel verpacken. Die infektiöse Natur foamyviraler genomischer DNA konnte bereits in früheren Veröffentlichungen gezeigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte nach Transfektion von Zellen mit aufgereinigter Virionen-DNA und anschließendem Überstandtransfer ein CPE in den infizierten Indikatorzellen induziert werden, was die Produktion infektiöser Viruspartikel bewies. Die -Aminogruppe von Lysin fungiert als potentieller Ubiquitinakzeptor. Für das singuläre Lysin im WT Gag-Protein von PFV konnte wie in früheren Veröffentlichungen keine Ubiquitinierung festgestellt werden, im Gegensatz dazu wurde bei vier der fünf PFV Substitutionsmutanten eine Ubiquitinierung der neu eingeführten Lysine detektiert. Diese kovalente Modifikation hatte jedoch keinen Einfluß auf die Env-Restriktion des PFV-Kapsidexportes aus der Zelle. Für FFV konnte sowohl für den WT als auch die Substitutionsmutanten weder eine LP- noch eine Gag-Ubiquitinierung festgestellt werden. Als wahrscheinliche Ursache dafür kommen Unterschiede in den Komponenten der Ubiquitinierungsmaschinerie zwischen humanen Zellen und Katzenzellen in Frage, weshalb die Analyse einer möglichen Ubiquitinierung der neu in FFV Gag eingeführten Lysine in Katzenzellen als Produktionszellen durchgeführt werden sollte. Die Replikationsfähigkeit mehrerer Substitutionsmutanten der Gegenwart von IFN- und - war im Vergleich zum WT stark eingeschränkt. Dies deutete darauf hin, daß IFN-vermittelte Abwehrmechanismen eine Rolle während der positiven Selektion der Lysin-zu-Arginin-Substitutionsmutanten gespielt haben könnten. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate zeigten, daß sich die PFV- sowie FFV-Lysinmutanten in ihrem Replikationsverhalten nicht von WT-Viren unterscheiden. Im Kontext einer über Millionen von Jahren andauernden Wirts-Erreger-Koevolution stellt jedoch der durch zelluläre Restriktionsfaktoren vermittelte Selektionsdruck auf das Virus einen wichtigen Aspekt dar. Demnach könnte die Substitution von Lysin gegen Arginin beispielsweise über eine veränderte kovalente Modifikation eine Interaktion mit antiretroviralen Restriktionsfaktoren der Wirtszelle modifiziert oder inhibiert haben, wodurch diese Mutanten im Verlauf der foamyviralen Evolution positiv selektioniert wurden. / Foamyviruses (FV) harbour several features which distinguishes them from orthoretroviruses and which they share with the hepadnaviruses. Beside differences in the genomic organization, the protein expression and the replication strategy this referrs to the morphogenesis of viral particles, in which the Gag protein plays the key role. In contrast to orthoretroviruses and like hepadnaviruses, cellular egress of FV capsids depends on the presence of cognate Env protein. In the first part of this work it was tried to identify an Env-interacting motif as well as essential amino acids (aa) involved in the recognition of the glycoprotein in PFV Gag. Therefore a chimeric construct containing parts of the Gag proteins of Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) and PFV was constructed. Like PFV Gag, the chimeric Gag proteins showed a perinuclear accumulation, a feature of PFV and MPMV assembly. Additionally, cellular export of the Gag chimerics was PFV Env restricted. This pointed to the integrity and functionality of the PFV Gag N-terminus in the chimeric construct. Nevertheless, chimeric Gag molekules didn´t multimerize to capsids or comparable particle structures. This was probably caused by massive sterical disorders, due to the involvement of heterologous protein domains. Therefore, the Gag chimerics didn´t represent an appropriate system for the functional analysis of the PFV Gag-Env interaction. Another peculiarity of foamyviral Gag proteins is their extremely low lysine content. In contrast to orthoretroviral Gag proteins, the main part of basic aa is represented by arginines. Due to the fact that more than 60 % of the arginine-specifying codons could have evolved out of lysine-specifying codons over a single point mutation, a positive selection of Gag mutants with a lysine-to-arginine substitution in the course of foamyviral evolution is likely. In the second part of this work, functions of arginines in foamyviral Gag proteins during replication were studied by using infectious molecular clones of PFV and FFV. Therefore several arginines were substituted for lysines. Additionally the single lysine in PFV Gag (K396) was mutated to arginine. All PFV as well as FFV mutants were replication-competent. Additionally, the single lysine in PFV Gag was non-essential for replication in immortalized cell culture, whereas replication was strongly inhibited in a primary cell line. One PFV substitution mutant (M141) induced an CPE in transfected 293T-cell culture, an indication of an involvement of this part of Gag in the interaction with the PFV glycoprotein. Upon ten cell-free passages of PFV Gag mutants in cell culture, neither revertants nor pseudorevertants appeared, indicating genetic stability during a short-term cell culture experiment. By application of AZT, an inhibitor of the foamyviral reverse transcription, on producer cells or target cells it was shown that the reverse transcription of the genomic RNA of the PFV Gag lysine mutants occured mainly in the producer cell and that they therefore didnt differ from wild-type (wt) virus with respect to replication strategy. By quantitative real-time PCR it was shown that PFV and FFV mutants incorporate DNA as well as RNA in particles. Like in recent publications, the infectiousness of foamyviral genomic DNA could be demonstrated in this work. By transfecting cells with extracted virion DNA and following supernatant transfer a CPE could be induced in the infected target cells, showing the production of infectious virus. The -aminogroup of lysine functions as a potential ubiquitin acceptor. Like in recent publications, no ubiquitination of the single lysine in PFV wt Gag could be detected. In contrast, four out of five PFV substitution mutants showed ubiquitination of the introduced lysines. Nevertheless, Gag mutants with this covalent modification didn´t have the ability to generate virus like particles (VLPs) or to be pseudotyped by heterologous Env. For FFV wt and mutants, neither Env leader peptide nor Gag ubiquitination could be detected. Differences in components of the ubiquitinination machinery between human cells and feline cells are a probable reason for this. Therefore the analysis of ubiquitiniation of the newly introduced lysines in FFV Gag should be carried out in feline cells as producer cells. Replication of several substitution mutants was strongly inhibited compared to wt virus in the presence of IFN- and -. These results indicated that IFN mediated defense mechanisms could have played a role in the positive selection of the lysine-to-arginine substitution mutants. These results show that the PFV and FFV mutants didn´t differ from wt viruses with respect to their replication strategy. In the context of the long-term host-pathogen coevolution the selection pressure on the virus mediated by cellular restriction factors represents an important aspect dar. The mutation from lysines to arginines implying an altered covalent modification of Gag could have lead to an modification or inhibition of the interaction with antiretroviral restriction factors of the host cell, leading to a positive selection of these mutants during foamyviral evolution.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist. / In the course of these studies it was shown that heterologous viral envelope proteins like the Env protein of MLV (murine leukemia virus) and the glycoprotein of VSV (vesicular stomatitis virus) are not able to substitute for the HFV Env protein in HF virus (human foamy virus) particle morphogenesis. These data suggest that HFV capsids require specific interactions with their homologous envelope protein in order to be enveloped and released from the cell. A mutational analysis revealed that the long membrane-spanning domain (MSD) of HFV Env plays a key role in this respect, since it cannot be replaced by alternative forms of membrane anchorage. The analysis of fusion activity of various HFV env mutants showed that the cytoplasmic domain (CyD) is not required to mediate membrane fusion. However, fusogenicity was lost when C-terminal parts of the MSD were deleted. Furthermore, it was shown, that mutations of the conserved lysine-proline motif within the MSD result in altered transport and fusion activity of HFV Env. Together, these data imply that the MSD of HFV Env does not only function as a domain that anchors the protein in the lipid bilayer. Instead, it appears that it adopts a specific conformation that is required to mediate different functions of the HFV Env protein.

Foamyviren (FVs) sind die genetisch stabilsten Viren der Retrovirus-Familie. Dies steht im Gegensatz zur Fehlerrate, die für die rekombinante FV Reverse Transkriptase (RT) gefunden wurde. Um die Genauigkeit der FV Genomreplikation in vivo zu ermitteln, analysierten wir das Auftreten von Mutationen nach FV-Vektortransfer in einer einzigen Replikationsrunde. Die Sequenzanalyse von mehr als 90000 Nukleotiden ergab 39 Mutationen. Dies entspricht einer Fehlerrate von ungefähr 4 x 10-4 pro Base und Replikationszyklus, wobei alle Mutationen Transitionen von G zu A waren. Eine schwache Expression von APOBEC-Enzymen in den vektorproduzierenden Zellen konnte als wahrscheinlichste Ursache für diesen Typ an Mutationen nachgewiesen werden. Das akzessorische FV Bet Protein wirkt APOBEC entgegen. Kotransfektion von Zellen mit einem bet-Expressionsplasmid resultierte in einer signifikanten Reduktion an Mutationen bei über 170000 zusätzlich sequenzierten Basen. Zwei Mutationen konnten nicht der APOBEC-Aktivität zugeschrieben werden, deshalb postulieren wir eine idealisierte FV-Mutationsrate von angenähert 7,5 x 10-6 pro Base und Replikationszyklus. Im Gegensatz zu in vitro-Analysen wurde nur eine einzige Deletion und keine Insertion bei mehr als 260000 sequenzierten Basen identifiziert. Die Analyse der Rekombinationsrate von FV-Vektorgenomen ergab mehr als ein zusätzliches Template-Switching-Ereignis pro reverser Transkription. Wir konnten auch zeigen, dass ein bestimmtes FV-Partikel in der Lage zum Crosstransfer eines heterologen FV-Genoms ist, jedoch mit einer reduzierten Effizienz als bei Verwendung des homologen Vektors. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse einerseits, dass das Kopieren des FV-Genoms mit höherer Genauigkeit geschieht als bisher angenommen, auf der anderen Seite ist Rekombination bei FV-Genomen wahrscheinlich. / Foamy viruses (FVs) are the genetically most stable viruses of the retrovirus family. This contrasts to the error rate found for recombinant FV reverse transcriptase (RT). To investigate the accuracy of FV genome copying in vivo we analyzed the occurrence of mutations after a single round of FV vector transfer. Sequence analysis of more than 90,000 nts revealed 39 mutations. This corresponds to an error rate of approx. 4 x 10-4 per site and replication cycle. All mutations were transitions from G to A. A residual expression of APOBEC enzymes in vector producer cells was found to be likely responsible for this type of mutation. The accessory FV Bet protein is implicated to counteract APOBEC. Cotransfection of cells with a bet expression plasmid resulted in a significant drop of mutations among over 170,000 additional sequenced bases. Since two mutations were not correlated to APOBEC activity, we postulate an idealized FV mutation rate of close to 7.5 x 10-6 per site and replication cycle. In contrast to in vitro studies only one deletion and no insertion was identified among the more than 260,000 sequenced bases. Analysis of the recombination frequency of FV vector genomes revealed more than one additional template-switching event per reverse transcription. We also show that a given FV particle is able to cross-transfer a heterologous FV genome, although at reduced efficiency than the homologous vector. Taken together, our results indicate that FV genome copying is of higher accuracy than thought previously. On the other hand recombination among FV genomes appears to be likely.

Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), der bei HIV-Infektionen in Kombination mit anderen antiretroviralen Substanzen eingesetzt wird. AZT zeigt darüberhinaus auch eine gute Wirksamkeit gegen Foamyviren, eine Subfamilie der Retroviren mit charakteristischen Besonderheiten in ihrer Molekularbiologie und ihrem Replikationszyklus, deren Vertreter verschiedene Affenarten und andere Säugetiere infizieren, wobei sie sich sowohl im jeweils natürlichen Wirt als auch bei seltener zufälliger Infektion des Menschen apathogen zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das AZT-resistente Foamyvirus SFVmacAZTres untersucht, das in Anwesenheit steigender AZT-Konzentrationen in Zellkultur selektiert worden war. Hierzu wurde SFVmacAZTres zunächst einer genotypischen Analyse unterzogen, wobei im Vergleich mit der wildtypischen Ausgangssequenz zwei Mutationen in gag und vier Mutationen in pol nachgewiesen wurden, die zu Änderungen auf Aminosäureebene führten. Mittels PCR wurden Fragmente, die alle sechs Mutationen oder nur die vier pol-Mutationen enthielten, aus der Sequenz von SFVmacAZTres amplifiziert und jeweils in einen SFVmac-Klon eingefügt. Im weiteren Verlauf zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen diesen beiden Konstrukten bezüglich der Replikation in Abwesenheit oder Anwesenheit von AZT, so dass gefolgert werden konnte, dass die gag-Mutationen keinen Beitrag zur AZT-Resistenz leisten. Die pol-Mutationen befanden sich sämtlich im für die Reverse Transkriptase kodierenden Bereich und führten zu den Aminosäuresubstitutionen K211I, I224T, S345T und E350K. An Position 224 fand sich dabei in einer veröffentlichten Sequenz bereits ein Threonin, so dass hier unabhängig von der Selektion in Anwesenheit von AZT möglicherweise ein Polymorphismus vorliegt. Der Vergleich der vier Mutationen der RT von SFVmacAZTres mit den bei HIV bekannten Mustern an Mutationen wie den TAMs und dem Q151M-Komplex zeigte keine Übereinstimmungen. Um den jeweiligen Beitrag der vier nachgewiesenen pol-Mutationen zur AZT-Resistenz zu untersuchen, wurden sie einzeln und in Kombinationen mittels zielgerichteter Mutagenese in einen SFVmac-Klon eingefügt und die entsprechenden Konstrukte auf ihre Replikation in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,5 µM, 5µM und 50 µM AZT untersucht. Hierfür wurden 293T-Zellen mit dem jeweiligen Plasmid transfiziert und nach Überprüfung der gleichmäßigen Expression von Gag und Pol mittels Western Blot der virushaltige Überstand auf Zielzellen gegeben und der Titer ausgezählt. Es konnte gezeigt werden, dass keines der Konstrukte mit Einzel , Doppel- und Dreifachmutationen eine ähnlich ausgeprägte AZT-Resistenz wie die Vierfachmutante aufwies, allerdings einige in unterschiedlichen Ausmaß teilresistent waren, während andere weder ohne noch mit AZT gut replizierten. S345T erwies sich vor E350K als die Mutation mit dem größten Beitrag zur AZT-Resistenz, I224T erhöhte den Titer in Abwesenheit und Anwesenheit um etwa den gleichen Faktor, wohingegen sich K211I in den meisten Kombinationen eher negativ auswirkte. Der Klon, in den alle vier Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese eingeführt worden waren, zeigte die gleiche AZT-Resistenz wie das in Zellkultur selektierte Virus. Damit war gezeigt, dass diese vier Mutationen sowohl notwendig als auch hinreichend für die AZT-Resistenz von SFVmacAZTres sind. Die pol-Mutationen von SFVmacAZTres wurden weiterhin soweit möglich an entsprechenden Stellen in Klon des prototypischen Foamyvirus PFV eingeführt, bei dem es zuvor nicht gelungen war, ein resistentes Isolat in Zellkultur zu generieren. Das PFV-Konstrukt mit den Mutationen aus SFVmacAZTres zeigte sich jedoch nicht AZT-resistent, sondern wies einen Replikationsdefekt auf. Einige HIV-Mutationen, die in den PFV-Klon eingefügt wurden, führten ebenfalls zu keiner AZT-Resistenz. Es bestehen also bezüglich AZT-Resistenz und damit gewisser Eigenschaften der Reversen Transkriptase deutliche Unterschiede zwischen PFV und SFVmac. Die durchgeführten Arbeiten stellen die Grundlage für weitere Untersuchungen dar, in denen beispielsweise dem biochemischen Mechanismus der AZT-Resistenz von SFVmacAZTres nachgegangen werden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis allgemeiner Mechanismen der NRTI-Resistenz bei Retroviren ebenso beitragen wie zur weiteren Charakterisierung der foamyviralen Reversen Transkriptase an sich. / Zidovudine or azidothymidine (AZT) is a nucleoside analog reverse transcriptase inhibitor (NRTI) which is used together with other substances for therapy of HIV infections. AZT can also be used to suppress foamy virus replication, a subfamily of retroviruses with distinct molecular biology and replication. AZT resistant foamy virus (SFVmacAZTres) which was generated in cell culture in presence of increasing AZT concentrations was analyzed in this study. First, a genotypic analysis was conducted, which showed 2 mutations in gag and 4 mutations in pol of this resistant virus when compared to the wildtype sequence. Infectious clones harbouring all 6 mutations or only the pol-mutations were constructed by amplifying the corresponding sequence of the resistant virus and cloning them into the wildtype sequence. There was no difference regarding virus replication in absence or presence of AZT between the virus with gag- and pol-mutations and the virus only harbouring the pol-mutations. Using site directed mutagenesis, the four pol mutations, namely K211I, I224T, S345T and E350K and double and triple combinations thereof were inserted into the infectious clone of SFVmac. These mutants, as well as the wildtype clone and the clone with all 4 mutations were compared in absence of AZT and at AZT concentrations of 0,5, 5, and 50 µM, using these concentrations in the virusproducing 293T-cell as well as in the target cells, BHKLTRlacZ. By counting of blue, and thereby, virus infected cells, it was demonstrated that no single, double or triple mutant displayed the same AZT resistance as the original resistant virus with all 4 mutations. Some combinations displayed deleterious effects, others partial resistance. S345T was identified as the most important mutation regarding AZT-resistance, while E350K and K211I only showed effects in combinations with other mutations and at high AZT concentrations. I224T raised the viral titre, which is reduced in absence of AZT by the other mutations, in absence or presence of AZT by the same factor. The mutations identified in SFVmac were also cloned in PFV. However, a AZT resistant PFV could not be generated.

Aufgrund ihrer gut dokumentierten, umfangreichen gesundheitsfördernden biologischen Aktivitäten wird den Flavonoiden eine große Bedeutung zugeordnet. Die Ergebnisse von in vitro- und Tierstudien deuten zudem darauf hin, dass diese Verbindungen bei der Prävention und Therapie von Erkrankungen wie Krebs oder Alzheimer Krankheit (AD) positive Effekte zeigen. Zur besseren Charakterisierung der Interaktion von Flavonoiden mit Krebszellen wurden von uns die Cytotoxizität verschiedener Flavonoide auf T-Lymphoblastomzellen untersucht und Strukturelemente identifiziert, welche für einen Flavonoid-induzierten Zelltod relevant sind. Weitere Studien waren der potentiell neuroprotektiven Wirkung von Flavonoiden gewidmet. Die sowohl in neuronalen Zellkulturen als auch in transgenen Alzheimer-Mäusen (TgAPPsw) festgestellte Erhöhung der sAPPα Produktion und Reduktion von Aβ-Bildung wurden mit Aktivitäts- und Expressionssteigerung der α-Sekretase ADAM-10 assoziiert. Um herauszufinden, ob Flavonoide eine neuroprotektive Wirkung zeigen, wurden erste Vorbereitungen für ein Flavonoid-Screening mit einer sowohl hAPP alsauch ADAM-10 stabil transfizierten HT1080 Zellen getroffen. Dies beinhaltete die Suche nach einer potenten siRNA/shRNA und einem effektiven Flavonoid. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Experimente durchgeführt, um die Rolle von Heparansulfat (HS) bei der foamyviralen Anbindung an die Wirtszelle zu untersuchen. Foamyviren (FV) sind Spumaviren und gehören zur Familie der Retroviren. Bei unseren Studien wurde die Bindung von FV an Heparin, die Korrelation der Suszeptibilität verschiedener Zellen mit zellulärem HS und die Reduktion der Infektion durch lösliches Heparin sowie durch enzymatischen HS-Abbau festgestellt. / Flavonoids have well-documented, beneficial biological effects. Furthermore different in vitro- and animal-experiments indicate that these compounds demonstrate positive effects in prevention and therapy of diseases, like cancer or neurodegenerative diseases. In order to characterize the interactionsbetween flavonoids and cancer cells, we examined the cytotoxicity of different flavonoids on a human leukemia cell line and identified structure elements that could be associated to flavonoid-induced cell death. Our further studies were dedicated to the potentially neuroprotective activity of flavonoids. It has been described that in neuronal cells as well as in transgenic AD mice EGCG increases levels of sAPPα- and reduces Aβ-production. This influence of EGCG was associated with enhanced activity and expression of the α-secretase, ADAM-10. To find out, if flavonoids showed neuroprotective activity, preliminary work for a later flavonoid screening on hAPP and ADAM-10 wit stably-transfected HT1080 cells was done. This includes the determination of flavonoid candidates and research of effective siRNAs towards ADAM-10. Furtherrmore we investigated the role of heparansulfat (HS) in attachment of FV to host cell. Foamyviruses (FV) are retroviruses and belong to the subfamily of spumaretroviruses. In our studies we discovered the binding of FV on heparin, the correlation between susceptibility of different cells and cellular HS and the reduction of infectivity through soluble heparin and through enzymatic HS-degradation.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch anhaltende Gelenksentzündungen gekennzeichnet ist und mit einer fortschreitenden Degradierung des Knorpels und Knochen einhergeht. Ungefähr 2 % der erwachsenen Bevölkerung weltweit sind betroffen und leiden unter erheblichen Gelenkschmerzen und Beeinträchtigungen. Der intraartikuläre Transfer anti-entzündlicher Gene (z.B. des Interleukin-1 Rezeptorantagonisten – IL1RA) zeigte signifikante Bedeutung in präklinischen und Phase-I klinischen Studien der RA Therapie. Die meisten dieser Studien verwendeten MLV-basierte orthoretrovirale Vektoren für eine stabile Transgenexpression, tragen aber das Risiko der Insertionsmutagenese. Wir haben foamyvirale Vektoren (FVV) etabliert, welche von apathogenen Elternviren abgeleitet sind und sich durch ein breites Wirtsspektrum und ein vorteilhaftes Integrationsmuster ins zelluläre Genom auszeichnen. In dieser Arbeit wurden IL1RA exprimierende prototypische foamyvirale Vektoren (PFV) generiert, deren chondroprotektives Potential in vitro und in einem indirekten Gentransferansatz in Kniegelenken von Wistar und athymischen Nacktratten in vivo evaluiert wurde. PFV Vektoren mit der kodierenden Sequenz für den humanen IL1RA, einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und EGFP wurden generiert und mit Verwendung eines Vier-Plasmidsystem, bestehend aus dem Vektorplasmid (IL1RA-IRES-EGFP) und den Expressionsplasmiden FV-gag, FV-pol und FV-env in 293T Zellen produziert. Ebenso wurden Kontrollvektoren welche nur EGFP exprimieren generiert. Transduktionsexperimente wurden mit primären humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZ) aus Knochenmarkaspiraten, der Tert-4 mesenchymalen Stammzelllinie, HT1080 Fibroblasten und primären Ratten Synovialfibroblasten durchgeführt. Die Transgenexpression wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (EGFP), ELISA (IL1RA) und quantitativer Real-Time PCR (IL1RA) evaluiert. Die Funktionalität des IL1RA-Proteins wurde mit einem Prostaglandin E2 (PGE2) Assay gezeigt. Dazu wurden FV.IL1RA transduzierte Tert-4 Zellen und unbehandelte Zellen mit 10 ng/ml IL1 inkubiert. Als readout für die IL1-Stimulation dienten die PGE2 Mengen in den konditionierten Medien. Die Zellkulturüberstände wurden 48 h nach IL1-Gabe auf ihren PGE2 und IL1RA Gehalt hin untersucht. Die PGE2 Menge war dabei, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, in den FV.IL1RA transduzierten Zellen signifikant erniedrigt. Nach der Transplantation von foamyviral transduzierten Synovialfibroblasten in Kniegelenke von Wistar und athymischen Nacktratten, war die intraartikuläre (i.a.) Transgenexpression in den Wistar Ratten zunächst hoch, fiel jedoch nach ungefähr 3 Wochen ab. Im Gegensatz dazu war die foamyviral vermittelte IL1RA-Expression in den immundefizienten Ratten für 12 Wochen auf sehr hohen Leveln stabil. Ein Maximum wurde an Tag 10 nach i.a. Transplantation mit ca. 450 ng pro Gelenk erreicht. Untersuchungen zur Biodistribution zeigten keine extraartikuläre Transgenexpression in allen untersuchten Organen (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Gonaden und Serum). Diese Resultate, zusammen mit dem Ausbleiben von sekundären Erkrankungen, wie bspw. Tumoren, in allen behandelten Tieren, sprechen für die Sicherheit des Ansatzes. Die Arbeit zeigt, dass FVV verwendet werden können, um primäre Synovialfibroblasten und MSZ effizient mit Markergenen und dem anti-entzündlichen IL1RA Transgen zu transduzieren. Die dabei erzielten Transgenlevel sind in der Lage, die Effekte von hochdosiertem IL1 zu blockieren. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass FVV sehr effiziente Werkzeuge für den ex vivo Gentransfer sind und unterstreichen ihr großes Potential für die Bereitstellung anti-entzündlicher Transgene in primären Zellen und Geweben. Zukünftig soll diese Technologie in Tiermodellen der Arthritis angewendet werden. Das Fernziel der Arbeiten besteht in der Etablierung und Evaluierung eines Gentransfersystems, welches die in vivo Applikation am Menschen erlaubt. / Rheuamtoid arthritis (RA) is an autoimmune disease with persistent joint inflammation that results in progressive degradation of cartilage and bone. Approximately 2 % of the adult population worldwide are estimated to be affected by RA and suffer from substantial joint pain and disability. The intra-articular transfer of anti-inflammatory genes (e.g. interleukin receptor antagonist protein – IL1RA) showed significant impact in preclinical and early phase clinical trials for RA therapy. Most of these studies used MLV-based orthoretroviral vectors for stable transgene expression, but carry the risk of insertional mutagenesis. We have established foamyviral vectors (FVV) that are derived from apathogenic parent viruses and are characterized by a broad host range and a favourable integration pattern into the cellular genome. Here we used prototype foamyvirus vectors (PFV) that expressed IL1RA and evaluated their protective effects in vitro and in an indirect gene transfer approach in knee joints of Wistar and athymic nude rats in vivo. PFV vectors carrying the coding sequence of the human IL1RA gene, along with EGFP (enhanced green fluorescent protein) linked via an internal ribosomal entry site (IRES), were generated and produced by using a four-plasmid system consisting of the vector plasmid (IL1RA-IRES-EGFP) and the expression plasmids FV-gag, FV-pol and FV-env in 293T cells. Control vectors were also generated that expressed EGFP only. Transduction experiments were performed with different cells including human primary mesenchymal stem cells (MSC) derived from bone marrow-aspirates, the Tert-4 mesenchymal stem cell line, the HT1080 fibroblast cell line and primary rat synovial fibroblasts. The transgene expression was evaluated by fluorescence microscopy (EGFP), flow cytometry (EGFP), ELISA (IL1RA) and realtime polymerase chain reaction (PCR) (IL1RA). Functionality of the IL1RA protein was shown by using a Prostaglandin E2 (PGE2) Assay. For this, FV.IL1RA transduced Tert-4 cells and untreated Tert-4 cells were incubated with 10 ng/ml IL1. As a readout for the IL1 stimulation, levels of PGE2 in conditioned media were determined. Cell culture supernatants were assayed 48 hours later for their PGE2 and IL1RA levels. The PGE2 levels were statistically significantly lower in the FV.IL1RA transduced cells in comparison to untreated controls. After the transplantation of foamyviral-transduced synovial fibroblasts in knee joints of Wistar and athymic nude rats, the intra-articular transgene expression in Wistar rats was initially high and declined after approximately 3 weeks. In contrast, foamyviral-mediated expression of human IL1RA was found to persist for at least 12 weeks at very high levels in immunocompromised rats, with a maximun value of approximately 450 ng human IL1RA per joint at day 10 after intra-articular transplantation. Biodistribution experiments were also performed and revealed the absence of extra-articular transgene expression in all organs analyzed (brain, heart, lung, liver, kidney, spleen, gonad and serum). This finding, along with the nonappearance of secondary disorders such as tumors in all animals treated, argue for the safety of the approach. Here we show that FV vectors can be used to efficiently transduce primary synovial fibroblasts as well as primary MSCs with marker genes as well as the anti-inflammatory IL1RA transgene at levels that were functional to block the effects of high doses of IL1. The results indicate that FV vectors are very efficient tools for ex vivo gene transfer and underscore their high value for delivering antiinflammatory transgenes to primary cells and tissues. In future experiments we aim to apply this technology in animal models of disease. The ultimate goal of this research is the establishment and evaluation of a gene transfer system that allows the application in humans.

In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Berücksichtung des FV Hüllglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. Über die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umhüllte Viren können entweder durch direkte Fusion der viralen Hülle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abhängigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellulärer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abhängigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. Ähnlich wie bei Vesikuläres Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen lässt. Eine Analyse der pH-Abhängigkeit der FV Env Fusionsaktivität in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivität mit einer maximalen Stärke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivität bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivität in saurem Milieu weist auf eine Konformationsänderung des Hüllglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abhängigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazitäts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verstärktes Grün Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Primärinfektion über einen intrazellulären Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die über einen Se-kundärzyklus mit Hilfe extrazellulärer Partikel stabil transduzieren können, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herkömmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant höhere persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erhöhte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten. / In this study, both, the analysis of the penetration mechanism of Foamy Viruses (FV), focusing on the FV envelope glycoprotein (Env), and the construction and analysis of Adenovirus (Ad)-FV hybrid vectors for efficient prolonged transgene expression, was addressed. Little is known about the uptake of foamy viruses, a subfamily of retroviruses, into target cells. In general enveloped viruses use two different entry strategies, an endocytotic entry pathway, mostly involving a pH-dependent fusion process, and a pH-independent fusion process at the cell membrane. In this study, we examined the pH dependence of FV entry by analyzing FV Env mediated infectivity of target cells in the presence of weak bases, vacuolar ATPase inhibitors and carboxylic ionophores using Murine Leukemia Virus (MuLV) or FV vector pseudotypes. Similiar to Vesicular Stomatitis Virus glycoprotein G (VSV-G) mediated uptake, FV Env mediated entry was inhibited by most agents used. However, in contrast to VSV-G pseudotypes, chloroquine failed to reduce the infectivity of FV Env pseudotypes, implying that the pathway is different from that of VSV-G. Various glycoproteins from other FV species showed a similiar inhibition pattern as the prototype FV (PFV). Analysis of the pH-dependence of the FV mediated fusion process in a cell-to-cell fusion assay revealed an induction of syncitia formation by a short exposure to acidic pH, peaking around pH 5.5. The very short time period of exposure to low pH neccessary for the induction of fusion activity implies a conformational change of FV Env at low pH to transform to a fusogenic state. Interestingly, of all FV Env species analyzed only the PFV Env had a significant fusion activity a neutral pH. Taken together, these data suggest a pH-dependent endocytotic pathway of infection of target cells by FV. In this work, an adenoviral/foamyviral (Ad-FV) hybrid vector system was developed to exploit the favourable features of the two parental viral species for efficient and stable gene transfer. The system consists of high capacity (HC-Ad) Adenovirus 5 vectors containing self-inactivating PFV vector cassettes under control of a human cytomegalovirus- (hCMV) promotor or the reverse Tet transactivator system (Tet). The PFV Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) transfer vectors encoded by this vector cassettes could either transduce target cells by an intracellular retrotransposition step or by an additional secondary cycle with extracellular paticles. The Ad-FV vectors could be produced with titers up to 1010 iU/ml, comparable to conventional Ad vectors. We were able to demonstrate the predicted pattern of PFV protein expression in Ad-FV vector infected cells and the induction of PFV protein expression in Ad-FVTet infected cells. Long-term analysis of cells infected by the chimeric vec-tors showed a significantly higher amount of persistent transgene expressing cells when compared to cells infected by a control vector containing a non-functional FV pol ORF or by a conventional HC-Ad vector. Southern blot analysis of persistently transgene expressing cells indicated stable integration of the PFV vector genome in cells infected by Ad-FVTet vectors. In summary, our results demonstrate the production of high titer Ad-FV hybrid vectors mediating, even compared to other published Ad-Retrovirus systems, prolonged transgene expression by stable integration.

Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation könnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschränktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2’ und P2 auf die Aminosäurereste Valin und Valin/Asparagin beschränkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschränkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollständige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivität-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollständige cDNA bilden können. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilität der wenigen Env-Trimere auf der Hüllmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molekül als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschränkten Env-Mobilität, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da für die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleinsäure benötigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Domänen für die Aktivierung der Protease benötigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivität resultierte, war die funktionelle RNaseH-Domäne essenziell für die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Domänen von anderen Retroviren resultierte in genomunabhängiger Proteaseaktivität in Zellen und genomabhängiger Proteaseaktivität in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden. / Retroviral Pol and structural proteins are processed by the viral protease. Here, central mechanisms of the foamy viral protease regulation were investigated and characterized. For determination of the relative Pol and Env encapsidation a novel chromatographic purification method was developed. In comparison with human immunodeficiency viruses, foamy viruses encapsidate less Pol but significantly more Env. Foamy viruses might compensate these low Pol amount by limiting Gag and Pol processing to a single cleavage site. I sought to investigate, whether a limited cleavage site repertoire of foamy viral protease might be a consequence of this restriction. In cell culture positions P2’ and P2 within the cleavage sites are invariant and restricted to valine and valine/asparagine, supporting the conclusion that foamy viral protease cleavage at more specific sites than its human immunodeficiency viral counterpart. Secondly, I could show that complete foamy viral reverse transcription is dependent on Gag maturation, since viruses deficient in protease activity or with an inactive Gag cleavage site were incapable of producing cDNA beyond the first strong stop. Thus, low protease encapsidation is compensated by a delay of the reverse transcription until sufficient Gag maturation occurred. The human immunodeficiency viral Gag processing triggers the mobility of the few Env trimmers on the viral membrane. This Env clustering was shown to be essential for infectivity. Here, foamy viral Env was quantified and found that foamy viruses incorporate 28 times more Env per Gag molecule than the human immunodeficiency viruses. It seems to be likely that these higher Env amounts are required to compensate for the lack of Env mobility due to the restricted Gag processing at a single site at the carboxyl terminus. The dimerization and activation of the foamy viral protease depends on the binding of viral RNA and protein-protein interactions. Since the protease is active in the Pol and in the PRRT context the Pol domains essential for protease activity were mapped. While deletion of the integrase in context of recombinant viruses resulted in reduced protease activity further deletion of the RNase H domains abolished protease function. Substituting the RNase H domain with the RNase H of other retroviruses could restore protease activity even in the absence of viral RNA in cells , but not in viruses. Thus, the RNase H domains serve as protein-protein interaction domain or might dimerize the PRRT domains by binding to unspecific RNA.

Stuttgart, Univ., Diss., 2006. / Enth. Zeitschriftenartikel aus: Virology ; 345 (2006) S. 502 - 508; PNAS ; 102 (2005) S. 7982 - 7987; Tierärztliche Umschau ; 59, (2004) S. 521 - 527; Gene Therapy ; 14 (2007) S. 613 - 620.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, progressive und systemische Autoimmunerkrankung, in deren Zentrum das dauerhaft entzündete Synovialgewebe der Gelenke steht. Aufgrund vielfältiger Knochen- und Knorpel-destruierender Prozesse kommt es zu irreversiblen Funktionalitätsverlusten der betroffenen Gelenke. Eine tragende Rolle bei der Ausprägung der klinischen Manifestationen wird dabei der exzessiven Synthese des proinflammatorischen Cytokins IL-1 zugesprochen. Dessen Aktivität kann durch kompetitive Blockade des IL-1 Rezeptors Typ I mit dem natürlich vorkommenden, antiinflammatorischen IL-1 Rezeptorantagonisten (IL-1Ra) inhibiert werden. Der Cytokin-blockierende Therapieansatz mit Anakinra, einem rekombinant hergestellten IL-1Ra, konnte die pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten der RA seit 2001 wesentlich erweitern. Gleichwohl erfordern die geringen Halbwertszeiten von IL-1Ra regelmäßige subkutane Injektionen, um hinreichende therapeutische Wirkstoffspiegel im Patienten aufrecht zu erhalten. Vor diesem Hintergrund bieten somatische Gentherapiekonzepte eine vielversprechende Alternative zu den konventionellen Behandlungsstrategien bei der RA-Therapie. Ein IL-1Ra-Gentransfer ins Gelenk soll die persistierende, lokale, endogene Synthese des therapeutischen IL-1Ra-Proteins ermöglichen und lässt in dieser Hinsicht eine nachhaltige Verbesserung der klinischen Symptomatik erwarten. In dieser Arbeit wurden dafür gentherapeutische Foamyvirus-Adenovirus-Hybridvektoren (FAD) zur Expression des IL-1Ra entwickelt und die Funktionalität der Konstrukte evaluiert. Die Vektoren sollten die effizienten adenoviralen Transduktionsmechanismen mit dem Potential der foamyviralen somatischen Integration für einen direkten in vivo Gentransfer kombinieren. Das System besteht aus einem adenoviralen Hochkapazitätsvektor vom Serotyp 5, der eine selbstinaktivierende PFV-Vektorkassette unter Kontrolle des Reversen Tetracyclin Transaktivator Systems (Tet-On) enthält. In FAD-transduzierten Zellen wurde die funktionelle Induzierbarkeit der PFV-Vektorexpression nachgewiesen und die Kinetik der PFV-Partikelfreisetzung charakterisiert. Nach Induktion der PFV-Vektorkassette konnte in FAD-transduzierten Zellen ein langfristig-stabiler IL-1Ra-Gentransfer gezeigt werden. Ferner konnten protektive Effekte eines FAD-vermittelten IL-1Ra-Gentransfers im Zellkulturmodell nachgewiesen werden. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten eine erfolgreiche Transduktion von Synovialzellen nach intraartikulärer Applikation von FAD-Vektoren. Das Tetracyclin-regulierbare Hybridvektorsystem zur Expression des IL-1Ra, das in der vorliegenden Arbeit geschaffen wurde, könnte zukünftig die Basis für ein effektives Werkzeug zum intraartikulären Gentransfer in der klinischen Praxis bieten. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, progressive and systemic autoimmune disease, characterized by invasive synovial hyperplasia. Several inflammatory cartilage- and bone- destroying processes lead to an irreversible loss of joint functionality. The excessive synthesis of the pro-inflammatory cytokine IL-1 has been implicated as a primary mediator of pathology in RA. The activity of IL-1 is initiated upon binding to the IL-1 receptor type I and can be inhibited by the naturally occurring anti-inflammatory IL-1 receptor antagonist (IL1-Ra) protein. The cytokine-blocking therapeutic approach with anakinra, a recombinant form of IL-1Ra, has significantly improved the pharmacological treatment of RA since 2001. Nevertheless, due to the short half-life of IL-1Ra, repeated subcutaneous injections are required to maintain therapeutic concentrations in the patient. Thus, somatic gene therapy may offer a promising alternative to conventional therapeutic strategies for treating RA. Following gene delivery of IL-1Ra, it may be expected that a sustained improvement of clinical symptoms is achievable due to the endogenous cellular synthesis and local secretion of the therapeutic IL-1Ra protein. In this work, foamy virus-adenovirus hybrid vectors (FAD) were developed for the expression of IL-1Ra and the functionality of the constructs was evaluated. The hybrids combine the high transduction efficiency of adenovirus vectors with the integrative potential provided by prototype foamy virus (PFV) vectors, for direct in vivo gene transfer. In the system, a complete expression cassette for self-inactivating PFV vectors, which is under the control of the tetracycline-dependent regulatory system (Tet-On), was inserted into the backbone of a serotype 5-based high-capacity adenoviral vector. In FAD-transduced cells, the induction of the PFV vector cassette was demonstrated and the release of secondary infectious PFV vectors was characterized. After the induction of the PFV vector cassette in FAD-transduced cells, a stable long-term IL1-Ra expression was shown. Furthermore, the anti-inflammatory potential of the FAD-mediated IL-1Ra gene transfer was successfully evaluated in a cell culture model. Animal studies indicated successful transduction of cells in the synovium after intra-articular application of FAD-vectors. The tetracycline-inducible hybrid vector system for the expression of IL-1Ra, which was created in the present work, may provide the future basis for an effective tool for intra-articular gene transfer in clinical settings.