Les Corynebacteriales sont un groupe de bactéries qui comprend des pathogènes de l’Homme, comme les agents de la tuberculose, de la lèpre et de la diphtérie. Ces bactéries se distinguent pas une enveloppe atypique formée de peptidoglycane, lié covalemment à un polymére sacharidique, l’arabinogalactane, lui-même estérifié par des acides mycoliques. Les acides mycoliques sont une classe d’acide gras α-hydroxylés β-branchés qui peuvent être retrouvés soit sous forme “libre”, où ils estérifient du tréhalose, soit sous forme “liés”, où ils estérifient l’arabinogalactane. Les acides mycoliques sont transférés sur leurs accepteurs par une classe d’enzymes spécifiques, les mycoloyltransférases. Les acides mycoliques sont les composants majeurs de la membrane externe des Corynebacteriales (“mycomembrane”). Récemment, il a été démontré que les acides mycoliques peuvent aussi être transférés sur des protéines.Jusqu’à récemment, l’utilisation de la spectrométrie de masse n’avait permis d’identifier que 3 protéines mycoloylées. PorA et PorH sont de petites protéines (45 et 57 résidus) qui forment un pore hétéro-oligomérique dans la membrane externe, alors que la fonction de ProtX (38 résidus) n’est pas connue. La mycoloyltransférase MytC est essentielle pour la mycoloylation des protéines.Dans le but de mieux comprendre la généralité et le rôle de la mycoloylation des protéines, une de nos objectifs était de déterminer si d’autres protéines sont mycoloylées chez C. glutamicum et, si c’est le cas, de les identifier. Pour ce faire, nous avons développé, chez cet organisme, une méthode de marquage métabolique dans laquelle un analogue d’acide gras est utilisé pour marquer les acides mycoliques. Si incorporé, cette sonde pourra réagir avec un conjugué azido-biotine, permettant alors la détection et/ou l’enrichissement des protéines lipidés. Nos résultats montrent que PorA, PorH et ProtX peuvent être marqués spécifiquement par cet analogue et que le marquage est dépendant de la présence de MytC et de Pks13, une enzyme clé dans la synthèse des acides mycoliques. Ces résultats indiquent donc qu’un analogue d’acide gras peut être utilisé pour caractériser des protéines mycoloylées potentielles. En effet, deux autres candidats, PorB et PorC ont été testés par cette approche et répondent positivement dans le test. Dans le cas de PorB et PorC, la mycoloylation semble favoriser l’association à l’enveloppe. / Corynebacteriales are a group of bacteria that comprise human pathogens, including the agents of tuberculosis, leprosy, and diphtheria. These bacteria are distinguished by an atypical envelope formed of peptidoglycan bonded to the arabinogalactan saccharide polymer, itself esterified with mycolic acids. Mycolic acids are a specific class of α-hydroxylated β-linked fatty acids, they are found either in a so-called "free" form where they esterify trehalose, or in a "linked" form, where they are covalently bound to arabinogalactan. Mycolic acids are transferred to their acceptors through a specific class of enzymes, mycoloyltransferases. Mycolic acids are the major components of the outer membrane of Corynebacteriales called mycomembrane. Recently, mycolic acids were also found covalently attached to proteins in C. glutamicum.So far, using mass spectrometry, only 3 proteins have been identified as mycoloylated. PorA and PorH are small proteins (45 and 57 residues) forming a hetero-oligomeric pore in the outer membrane whereas the function of ProtX (38 residues) is still unknown. The mycoloyltransferase MytC is essential for protein mycoloylation.In order to gain insights in the extent and function of protein mycoloylation, one of our objectives was to determine whether other proteins are mycoloylated in C. glutamicum and if so, identify them. To do so, we developed in this organism a metabolic labeling approach in which a fatty acid chemical reporter is used to label mycolic acids. If incorporated, this reporter could react with an azido-biotin conjugate, allowing the detection and/or enrichment of lipidated proteins. Our results show that PorA, PorH and ProtX can be specifically labeled with such a reporter, and that this labeling is strictly dependent on the presence of MytC and Pks13, the key enzyme allowing mycolic acids biosynthesis. These results hence indicate that fatty acid chemical reporter can be used to characterize putative mycoloylated proteins. Indeed, two other candidates, PorB and PorC, were tested for mycoloylation using this approach and found to positively respond in the click-chemistry assay. In the case of PorB and PorB, mycoloylation appears to favor association to the envelope.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017SACLS547 |
| Date | 19 December 2017 |
| Creators | Issa, Hanane |
| Contributors | Paris Saclay, Bayan, Nicolas, Hage, Faten El, Dautin, Nathalie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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