Les Corynebacteriales sont un groupe de bactéries qui comprend des pathogènes de l’Homme, comme les agents de la tuberculose, de la lèpre et de la diphtérie. Ces bactéries se distinguent pas une enveloppe atypique formée de peptidoglycane, lié covalemment à un polymére sacharidique, l’arabinogalactane, lui-même estérifié par des acides mycoliques. Les acides mycoliques sont une classe d’acide gras α-hydroxylés β-branchés qui peuvent être retrouvés soit sous forme “libre”, où ils estérifient du tréhalose, soit sous forme “liés”, où ils estérifient l’arabinogalactane. Les acides mycoliques sont transférés sur leurs accepteurs par une classe d’enzymes spécifiques, les mycoloyltransférases. Les acides mycoliques sont les composants majeurs de la membrane externe des Corynebacteriales (“mycomembrane”). Récemment, il a été démontré que les acides mycoliques peuvent aussi être transférés sur des protéines.Jusqu’à récemment, l’utilisation de la spectrométrie de masse n’avait permis d’identifier que 3 protéines mycoloylées. PorA et PorH sont de petites protéines (45 et 57 résidus) qui forment un pore hétéro-oligomérique dans la membrane externe, alors que la fonction de ProtX (38 résidus) n’est pas connue. La mycoloyltransférase MytC est essentielle pour la mycoloylation des protéines.Dans le but de mieux comprendre la généralité et le rôle de la mycoloylation des protéines, une de nos objectifs était de déterminer si d’autres protéines sont mycoloylées chez C. glutamicum et, si c’est le cas, de les identifier. Pour ce faire, nous avons développé, chez cet organisme, une méthode de marquage métabolique dans laquelle un analogue d’acide gras est utilisé pour marquer les acides mycoliques. Si incorporé, cette sonde pourra réagir avec un conjugué azido-biotine, permettant alors la détection et/ou l’enrichissement des protéines lipidés. Nos résultats montrent que PorA, PorH et ProtX peuvent être marqués spécifiquement par cet analogue et que le marquage est dépendant de la présence de MytC et de Pks13, une enzyme clé dans la synthèse des acides mycoliques. Ces résultats indiquent donc qu’un analogue d’acide gras peut être utilisé pour caractériser des protéines mycoloylées potentielles. En effet, deux autres candidats, PorB et PorC ont été testés par cette approche et répondent positivement dans le test. Dans le cas de PorB et PorC, la mycoloylation semble favoriser l’association à l’enveloppe. / Corynebacteriales are a group of bacteria that comprise human pathogens, including the agents of tuberculosis, leprosy, and diphtheria. These bacteria are distinguished by an atypical envelope formed of peptidoglycan bonded to the arabinogalactan saccharide polymer, itself esterified with mycolic acids. Mycolic acids are a specific class of α-hydroxylated β-linked fatty acids, they are found either in a so-called "free" form where they esterify trehalose, or in a "linked" form, where they are covalently bound to arabinogalactan. Mycolic acids are transferred to their acceptors through a specific class of enzymes, mycoloyltransferases. Mycolic acids are the major components of the outer membrane of Corynebacteriales called mycomembrane. Recently, mycolic acids were also found covalently attached to proteins in C. glutamicum.So far, using mass spectrometry, only 3 proteins have been identified as mycoloylated. PorA and PorH are small proteins (45 and 57 residues) forming a hetero-oligomeric pore in the outer membrane whereas the function of ProtX (38 residues) is still unknown. The mycoloyltransferase MytC is essential for protein mycoloylation.In order to gain insights in the extent and function of protein mycoloylation, one of our objectives was to determine whether other proteins are mycoloylated in C. glutamicum and if so, identify them. To do so, we developed in this organism a metabolic labeling approach in which a fatty acid chemical reporter is used to label mycolic acids. If incorporated, this reporter could react with an azido-biotin conjugate, allowing the detection and/or enrichment of lipidated proteins. Our results show that PorA, PorH and ProtX can be specifically labeled with such a reporter, and that this labeling is strictly dependent on the presence of MytC and Pks13, the key enzyme allowing mycolic acids biosynthesis. These results hence indicate that fatty acid chemical reporter can be used to characterize putative mycoloylated proteins. Indeed, two other candidates, PorB and PorC, were tested for mycoloylation using this approach and found to positively respond in the click-chemistry assay. In the case of PorB and PorB, mycoloylation appears to favor association to the envelope.

Les biofilms, communautés multicellulaires bactériennes, sont omniprésents. Malgré leur importance pour l’écosystème, ils présentent une menace pour l'industrie autant que pour la santé humaine. La virulence des biofilms procède surtout de leur résistance élevée aux antibiotiques, qui rend leur éradication quasiment impossible. Ainsi, les biofilms sont impliqués dans la plupart des infections bactériennes chroniques, causant chaque année plus de 4000 décès en France. P. stuartii est une bactérie connue pour sa capacité à former des biofilms dans le tractus urinaire humain. Elle est responsable de 10% des INU chroniques et est décrite comme étant la plus résistante de son genre. Malgré ces faits, les études menées sur cette bactérie sont rares, freinant la compréhension du mécanisme de développement et de résistance de ses biofilms et compliquant ainsi l’avancement de nouvelles thérapies pour lutter, prévenir ou éradiquer ces infections. P. stuartii exprime au niveau de sa membrane externe deux porines, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, qui constituent 70% du contenu protéique membranaire. Ces porines sont le conduit principal permettant à la bactérie de communiquer et d’échanger avec son milieu environnant. Ainsi, les porines sont vitales pour la bactérie.A ce jour, trois publications sont disponibles qui traitent de ces deux porines, mais aucune n’a exploré leur influence sur la formation des biofilms bactériens. Les travaux effectués au cours de ma thèse ont ainsi visé à réduire le manque de connaissance sur les biofilms de P. stuartii et à dévoiler le rôle des porines dans l’établissement et la résistance de ces biofilms. Pour cela, nous avons segmenté notre travail en quatre parties ayant pour objectifs (1) de comprendre la formation des biofilms de P. stuartii et leur réponse aux stress du milieu environnant ; (2) de décrire l’effet de la suppression ou la surexpression des porines ; (3) d’étudier à l’échelle moléculaire et atomique le comportement des porines isolées ; et (4) de développer des outils pour étudier les porines à l’échelle moléculaire au sein d’un biofilm de P. stuartii. / Biofilms, bacterial multicellular communities, are ubiquitous. Despite their importance to the ecosystem, they pose a threat to both industry and human health. The virulence of biofilms is mainly due to their high resistance to antibiotics, which makes their eradication virtually impossible. Thus, biofilms are involved in most chronic bacterial infections, causing each year more than 4,000 deaths in France. P. stuartii is a bacterium known for its ability to form biofilms in the human urinary tract. It is responsible for 10% of chronic nosocomial urinary infections and is described as the most resistant of its kind. Despite these facts, studies on this bacterium are rare, hampering the understanding of the mechanism of development and resistance of its biofilms and thus complicating the advancement of new therapies to fight, prevent or eradicate these infections. P. stuartii expresses at its outer membrane two porins, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, which constitute 70% of the membrane protein content. These porins are the main conduit allowing the bacterium to communicate and exchange with its surrounding environment. Thus, porins are vital for the bacteria.To date, three publications are available that deal with these two porins, but none have explored their influence on the formation of bacterial biofilms. The work carried out during my thesis thus aimed to reduce the lack of knowledge about P. stuartii's biofilm and to unveil the role of porins in the establishment and resistance of these biofilms. For this, we have divided our work into four parts aiming at (1) understanding of P. stuartii's biofilms formation and their response to the stresses of the surrounding environment; (2) describing the effect of suppression or overexpression of porins; (3) studying the behavior of isolated porins on a molecular and atomic scale; and (4) developing tools for studying porins on a molecular scale within a biofilm of P. stuartii.

Les porines sont des protéines « canal » qui assurent la diffusion non-spécifique des ions et nutriments au sein des bactéries à Gram-négatif. Elles sont également la voie d'entrée des antibiotiques hydrophiles, en particulier les β-lactames. Des mutations au sein des porines, ou leur sous-expression, ont été rapportées dans de nombreux cas d'infections multi-résistantes au cours de la dernière décade, soulignant le rôle de ces protéines dans la résistance aux antibiotiques.La première partie de ma thèse a porté sur l'étude des relations structure fonction au sein des deux porines non spécifiques de Providencia stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2. Il a été montré qu'Omp-Pst1 est majoritairement responsable de l'entrée des antibiotiques. Afin de comprendre comment évolue cette porine in situ, nous avons réalisé une étude comparative sur les variantes d'Omp-Pst1 issues de la souche sauvage et de deux isolats cliniques. Globalement, ces structures pointent vers un consensus dans l'adaptation des porines in situ, lequel repose sur l'accumulation de résidus chargés positivement dans les boucles extracellulaires et dans le canal. Cette observation est en accord avec les mesures de translocation effectuées à l'échelle de la porine unique, lesquelles montrent une diffusion ralentie des antibiotiques chargés négativement au travers des porines issues des isolats cliniques. Mis ensemble, nos résultats démontrent le rôle critique joué par les porines dans la résistance aux antibiotiques, lequel vise à diminuer l'influx de ces derniers tout en conservant l'habilité pour la bactérie de se nourrir.La deuxième partie de ma thèse s'est focalisée sur une fonction inédite des porines, à savoir leur rôle dans l'association intercellulaire et la genèse de biofilms bactériens. Les porines sont généralement exprimées sous la forme de trimères fonctionnels enchâssés dans la membrane externe des bactéries à Gram-négatif. Le mécanisme d'adhésion mis en évidence par mes travaux de thèse repose sur la formation de dimères de trimères de porines, associées face à face par leurs boucles externes, grâce à une interaction de type steric zipper. En exploitant un large panel de méthodologies biophysiques et d'imageries, nous avons caractérisé les propriétés adhésives d'Omp-Pst1 et Omp-Pst2, à la fois in vitro et in vivo. Nous avons également investigué le transport de petites molécules fluorescentes au travers de ces dimères de porines, afin de vérifier leur putative implication dans la communication intercellulaire. Nos résultats démontrent la capacité des porines Omp-Pst1 et Omp-Pst2 à former des jonctions intercellulaires et les suggèrent donc comme des cibles thérapeutiques prometteuses dans la lutte contre les infections bactériennes. / Present in the outer membrane of bacteria, porins are the main gateway for soluble molecules, such as nutrients and ions, into the bacteria. They are also the way taken by hydrophilic antibiotics to reach their targets and kill the cell. Under the strong selective pressure caused by antibiotic overuse, bacteria have evolved modified porins that are less permeable to antibiotics. Although not the only strategy developed by bacteria to survive drug treatment, it is an important factor in the spreading phenomenon of multidrug resistant infections.In order to gain further insights into the molecular determinants of antibiotic translocation, the first part of my thesis work aimed at resolving the crystallographic structures of Omp-Pst1 and Omp-Pst2, two non-specific porins encoded in the genome of Providencia stuartii. This bacterial species is not very invasive and, therefore, causes endemic rather than epidemic infections. However, these infections are often fatal given the intrinsically stringent MDR phenotype of this species. It has been shown that Omp-Pst1 is the main entrance for β-lactam antibiotics. To provide structural and functional insights into the contribution of P. stuartii porins to antibiotic resistance phenotypes, structural analysis was undertaken, not only from the wild type strain but also from two clinical mutant strains i.e. Omp-Pst1-99645 and Omp-Pst1-Nea16. Mutations result in more pronounced anion selectivity due to an increased number of positively charged amino acids lining the pore and mostly in the extracellular loops in both mutants compared to the wild type. To further determine whether these mutations contributed to a decrease in antibiotic uptake, we undertook the characterization of β-lactam antibiotics transport kinetics using electrophysiology studies at the single protein level. For the zwitterionic β-lactam tested, single-molecule conductance measurements evidenced a decrease in the association rate constant, in both mutants compared to the wild type. However, we observed instead an increase in these values for the negatively charged β-lactam, which is in good agreement with our structure-based analysis. All together, our results point towards porins playing a major role in the antibiotic resistance mechanism by reducing drug uptake.In the second part of my thesis work, we discovered that porins could self-associate to form adhesive junctions between two cells and could provide the initial scaffold for the establishment of biofilms at early stages of their developpement. The self-matching interaction is mediated by a steric zipper interaction and involves their extracellular loops. In order to confirm the adhesive proprieties of porins, we exploited a large panel of biophysical and imaging methods both in vitro and in vivo. Furthermore, we studied their diffusive proprieties in reconstituted liposomes, to explore whether these self-matching interactions between porins could play a role in cell-to-cell communication. Our results point at a major role of P. stuartii porins, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, in cell-to-cell adhesion and make them promising targets to disrupt bacterial biofilm infections.

Campylobacter est responsable de la majorité des gastro-entérites bactériennes dans le monde. Sa membrane externe contient des porines qui permettent les échanges entre la bactérie et le milieu extérieur. Elles sont une des voies principales d’entrée pour les antibiotiques et les nutriments. Le premier objectif de mon travail était de participer à la caractérisation des porines MOMP et Omp50. Nous avons purifié ces protéines dans le cadre de collaborations pour l’étude des propriétés biophysiques de ces porines (M. Wintherhalter, Université Jacob, Allemagne) et la détermination de leur structure par cristallisation (J. Naismith, Université St Andrews, Écosse). La deuxième partie de ma thèse a été consacrée à l’étude et la caractérisation du produit du gène Cj1169c qui est en opéron avec le gène codant Omp50. Nous avons cloné et exprimé le gène Cj1169c chez Escherichia coli, ce qui a permis de purifier la protéine et de produire des anticorps spécifiques. Ces anticorps ont été utilisés pour étudier la prévalence de Cj1169c chez les espèces les plus fréquentes. Nous avons montré qu’elle était présente uniquement chez C. jejuni et C. lari et absente chez C. coli. En deuxième lieu, nous avons caractérisé sa production en fonction de conditions de culture et montré qu’elle dépendait du pH et de la température. Nous avons ensuite démontré que cette protéine est située dans le périplasme de Campylobacter. Puis, en raison de la présence de deux résidus de cystéines dans sa séquence, nous avons étudié son comportement en présence et en absence d’agents réducteurs de ponts disulfures. De plus, des résultats préliminaires suggèrent que cette protéine interagit avec Omp50. / Campylobacter is a leading cause of bacterial gastroenteritis worldwide. Its outer membrane contains porins which are pore forming protein that transport hydrophilic compounds like nutrients and antibiotics into the bacteria. My first objective was to purify the two porins MOMP and Omp50 from C. jejuni, in order to allow the study of the biophysical properties of porins (Collaboration with Mr. Wintherhalter, Jacob University, Germany), and to determine the structure of these porins by crystallization (Collaboration with J. Naismith, St Andrews University, Scotland).The second part of my thesis was devoted to the study of the product of the gene Cj1169c which is operonic with the Omp50 coding gene. We cloned and expressed the gene Cj1169c in Escherichia coli, purified the protein and produced Cj1169c-specific antibodies. We studied the prevalence of this protein in the most frequent species of Campylobacter and found the protein only in C. jejuni and C. lari never in C. coli. Then, we also studied the Cj1169c production in the function of several growing conditions, and we found that it depended on the pH and temperature. Besides, we demonstrated by several methods that this protein is located in the periplasmic compartment of the bacteria. Furthermore, because it contains two cysteins residues in its primary sequence, we studied the Cj1169c behavior in the presence and absence of disulfide bond reducing agents. In addition, preliminary results suggest that this protein interacts with Omp50.

Les biofilms bactériens, communautés multicellulaires adhérentes à une surface et enrobées d’une matrice extracellulaire, sont cruciaux pour le maintien de la plupart des écosystèmes de notre planète mais représentent également une menace pour la santé humaine. Leur éradication est un véritable défi pour la microbiologie moderne du fait de leur résistance élevée aux antibiotiques. Providencia stuartii est une bactérie Gram-négative connue pour sa forte capacité à former des biofilms dans le tractus urinaire humain, qui est responsable pour environ 10% des infections nosocomiales urinaires chroniques. Nous avons montré que cette souche bactérienne exploite un moyen de socialisation supplémentaire préalable à l’adhésion des cellules aux surfaces et la sécrétion d’une matrice extracellulaire, les communautés flottantes. Les deux porines de P. stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, soutiennent la formation des communautés flottantes en s’auto-associant à travers leurs boucles extracellulaires pour former des dimères de trimères (DOTs) intercellulaires. La formation des DOTs, rivetant les cellules adjacentes entre elles, est médiée par des forces électrostatiques et des interactions de type steric zipper.Les deux grands objectifs de la thèse ont été i) de caractériser les impacts environnementaux sur l’établissement et la survie des deux types de communautés formés par P. stuartii, et ii) d’empêcher la socialisation bactérienne par inhibition des DOTs de porines. Nos résultats ont montrés que des peptides mimant les résidus impliqués dans les interactions de type stérique zipper des DOTs de porines, et couplés à de la coumarine, sont prometteurs pour diagnostiquer les infections à P. stuartii. De plus, nous avons mis en avant qu’une combinaison d’antibiotiques avec certains de ces peptides est une nouvelle approche thérapeutique envisageable pour lutter contre les infections de P. stuartii. Nos résultats montrent aussi que les futurs traitements devraient être évalués sur les communautés flottantes et les biofilms adhérents, dans des conditions imitant les voies urinaires, afin d’être efficaces et potentiellement éradiquer P. stuartii. / Bacterial biofilms are multicellular communities adherent to surfaces and surrounded by an extracellular matrix. They are crucial for maintaining most of our planet’s ecosystems, but also a threat to human health. Biofilm eradication is one of the greatest challenges of modern microbiology due to their high resistance to antibiotics. In this PhD, we focused on Providencia stuartii, a Gram-negative pathogen that forms biofilms in the human urinary tract and is responsible for about 10% of hospital-acquired urinary tract infections. P. stuartii exploits an additional means of socialization, forming floating communities of cells (FCCs), that later sediment and adhere onto surfaces yielding surface-attached biofilms (SABs). The two porins of P. stuartii, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, are involved in FCC formation by self-association into intercellular dimers of trimers (DOTs). The main driving force behind DOT formation is electrostatic attraction, yet the DOT structure is locked-in by steric zipper interactions between facing extracellular loops.The two main objectives of this PhD were (i) to characterize the environmental impacts on the establishment and survival of the two type of socialized communities formed by P. stuartii, and (ii) to inhibit bacterial socialization by targeting porin DOTs. Our results reveal that peptides featuring residues involved in the steric zipper interaction of DOTs, and coupled with coumarin, are promising lead compound to diagnose P. stuartii infections. In addition, we tested combinations of antibiotics with some of these peptides and results suggest that is was a new therapeutic approach that can be envisaged to fight against P. stuartii infections. Future treatments should be evaluated on FCCs and SABs in conditions mimicking urinary tract, to be efficient and potentially eradicate P. stuartii.

Chez les bactéries à Gram-négatif, l’imperméabilité de la membrane externe est un facteur majeur contribuant au développement de la résistance. Chez Escherichia coli, les porines OmpF et OmpC sont des protéines de la membrane externe qui forment des canaux pour la diffusion de petites molécules hydrophiles tels que les antibiotiques. L’expression des porines est soumise à une régulation fine, et des petits ARN non-codants (sRNAs, small RNAs) jouent un rôle important au niveau post-transcriptionnel. Dans ce cadre, et en utilisant E. coli comme bactérie modèle, les objectifs de mon travail de thèse étaient : (1) de caractériser la régulation du sRNA MicC et la co-régulation putative de la porine quiescente OmpN; (2) d’examiner l'effet global de MicC sur le transcriptome; (3) d’analyser l'impact de l'expression de MicC sur la sensibilité aux antibiotiques. Les résultats obtenus montrent l’induction de MicC en présence d'antibiotiques de la famille des β-lactamines, ou en l’absence du facteur sigma de réponse au stress de l’enveloppe sigmaE. Ces mêmes conditions activent aussi l'activité d'une fusion ompN-lacZ, indiquant une régulation transcriptionnelle commune de micC et ompN. Etant donnée la conservation de MicC chez les entérobactéries, nous avons effectué une étude par RNASeq pour déterminer l'impact de la surexpression de MicC sur le transcriptome d’E. coli et identifié 60 ARNm régulés par MicC en plus de sa cible initiale ompC. L'identification des spectres cibles globaux des sRNAs est importante pour comprendre leur importance dans la physiologie bactérienne, ici celui de MicC dans la résistance aux antibiotiques. / A major factor contributing to antimicrobial resistance is the inability of antibiotics to penetrate the bacterial outer membrane to reach their target. In Escherichia coli, the two abundantly expressed porins OmpF and OmpC form channels for diffusion of small hydrophilic molecules including antibiotics. The expression of porins is under complex regulation and the small regulatory RNAs (sRNAs) fine tune the porin expression level at post-transcriptional level. MicF and MicC are the two major sRNAs that negatively regulate expression of OmpF and OmpC, respectively. Interestingly, these two sRNAs are encoded next to porin gene, i.e. micF-ompC and micC-ompN, suggesting a dual regulation. Our goals in this work were: (1) to characterize the regulation of the sRNA MicC and the putative co-regulation of the quiescent porin OmpN in E. coli; (2) to examine the global effect of MicC on the E. coli transcriptome; (3) to analyze the impact of MicC expression on antibiotic susceptibility. Our work shows that the expression of micC was increased in the presence of carbapenems and cephalosporins and in an rpoE depleted mutant. The same conditions enhanced the expression of OmpN, suggesting a dual regulation of micC and ompN. We also performed RNA sequencing to determine the impact of MicC overexpression on E. coli transcriptome. This identified 60 mRNA targets negatively regulated by MicC apart from its original target. Identification of the global target spectra of MicC is of importance to understand its importance on the overall bacterial physiology, and more specifically on AMR.

La perméabilité membranaire joue un rôle important dans la résistance aux antibiotiques chez lesbactéries à Gram négatif.L’objectif de notre travail était de caractériser la fonction tenue par les deux régulateurs globaux dela perméabilité membranaire chez Enterobacer aerogenes: mar et ram. L’objectif initial futd’identifier le répresseur spécifique de RamA qui manquait en tant qu’élément de la cascade derégulation actuellement définie. La sélection de 60 souches nous a permis de confirmer le rôlecentral joué par RamA dans la régulation, ainsi qu’identifier des mutations pouvant être critiques, auniveau de RamR. Ainsi, l’absence variations observées dans le régulon marRAB et l’expressionmodérée des transcrits montrée par qRT-PCR laisse penser, que RamA a un rôle clef dans larégulation de l’expression des porines et des pompes d’efflux chez E. aerogenes.L’autre partie de notre travail reposait sur l’étude de la translocation des antibiotiques au traversdes porines. L’étude des interactions porine-carbapénèmes s’est faite sur la porine sauvage OmpFd'Escherichia coli et deux mutations. Les résultats indiquent également l'importance de l'aspartateen position 113 dans la sélectivité de translocation des carbapénèmes au sein de la porine OmpF.Ce travail montre ainsi que la translocation des pénicillines est aussi sous la dépendance desinteractions qui se créent entre le substrat et le résidu en position 113 de OmpF et limitent alorsleur passage au niveau du canal porine. Nous avons recherché la contribution attribuée à la porineOmp36 d'E. aerogenes dans la translocation de certaines béta-lactamines. Les mesures ont permisde conclure que les deux beta-lactamin / Genetic permeability plays an important role in antibiotic resistance of Gram-negative bacteria.Our work was to characterize and better understand of the genetic regulation of membranepermeability in E. aerogenes. We focused on two global regulators, mar and ram, in about 60clinical isolates. Alterations in the upstream region of ramA and in ramR but no mutations in marAnor marR were observed. Overexpression of ramA or ramR led to an altered antibiotic susceptibilityassociated to decrease of porins expression and over-expression of efflux-pumps. qRT-PCR pointedout the estimated importance of the ram-regulon in the regulation cascade.Another part of this work was to characterize the translocation of compounds through porins andthe role of porins in drug uptake in general. Measurement of the rate of antibiotic action of threecarbapenems in an E. coli strain solely expressing OmpF as porin clearly indicated the importanceof the aspartate at position 113 in antibiotic translocation. A multi-disciplinary three way approachof computer modeling, black-lipid-bilayer assays and measurement of antibiotic action, suggestedthat interactions with residue D113 of E. coli porin OmpF are rate-limiting for transport throughthe porin channel. Combination of biological and biophysical measurements with E. aerogenesporin Omp36 denoted that interactions between the porin channel and the antibiotic facilitate andaccelerate transport.