Frühgeburtlichkeit ist eine Pandemie. Im Jahr 2020 wurden schätzungsweise 13,4 Millionen Babys als Frühgeburten, d. h. vor der 37. Schwangerschaftswoche, geboren. Komplikationen bei Frühgeburten sind die häufigste Todesursache bei Kindern unter 5 Jahren (ca. 900 000 Todesfälle im Jahr 2019). Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine Form der chronischen Lungenerkrankung, von der Neugeborene betroffen sind, vor allem solche, die als Frühgeborene zur Welt kommen und eine Sauerstofftherapie benötigen. Bei der BPD werden die Lungen und die Alveolen geschädigt, was zu Gewebezerstörung (Dysplasie) und Narbenbildung führt. Leider konzentrieren sich die derzeitigen Behandlungen der BPD auf die Bewältigung der Krankheit, da es derzeit keine heilende Therapie gibt. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass mesenchymale Stamm-/Stromzellen (MSCs) in der regenerativen Medizin zur Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden können. MSCs sind multipotente Zellen, die sich in verschiedene Zelltypen differenzieren und immunmodulatorische, entzündungshemmende, antioxidative und regenerative Eigenschaften besitzen. Sowohl präklinische als auch klinische Studien mit MSCs bei BPD haben erste vielversprechende Ergebnisse gezeigt. Kürzlich zeigten Möbius et al. jedoch widersprüchliche Ergebnisse, indem sie feststellten, dass eine prophylaktische Verabreichung von aus der menschlichen Nabelschnur stammenden MSC (UC-MSCs) eine gestörte Lungenentwicklung bei extrem früh geborenen nicht-menschlichen Primaten (Papio spp.) nicht verhindern konnte, wie es von Studien an anderen Modellorganismen erwartet wurde. Deshalb habe ich mich auf die Suche nach möglichen Erklärungen für diese Beobachtungen gemacht und mich dabei auf die lungeneigenen MSCs (L-MSCs) der Paviane konzentriert. Das primäre Ziel meines Promotionsprojekts war es, eine erste Charakterisierung und einen Vergleich der residenten L-MSCs sowohl von Placebo- als auch von UC-MSC-behandelten Frühgeborenen vorzunehmen. Das zweite Ziel meines Projekts war es, ein robustes und reproduzierbares (direktes) Ko-Kultur-Modell von L-MSCs und HUVECs zu etablieren. Wir haben uns für HUVECs entschieden, da diese Zellen von Neugeborenen stammen und es sich gezeigt hat, dass eine starke und komplexe Interaktion zwischen MSCs und blutgefäßbildenden Endothelzellen vor und während der Bildung von Mikrogefäßen für eine ordnungsgemäße Blut- und Sauerstoffzirkulation in der sich entwickelnden Lunge (Alveolen) besteht. Meine ersten Ergebnisse zeigen, dass es sich bei beiden Gruppen um echte MSCs handelt, da alle sechs (drei aus jeder Gruppe) in der Lage waren, sich an Kunststoff-Zellkulturplatten anzuheften, eine dreistufige Differenzierung in die Adipozyten-, Osteozyten- und Chondrozytenlinien zeigten und die MSC-Markergene CD73 (5'-Nukleotidase), CD90 (Thy-1) und CD105 (Endoglin) exprimierten, die vom ISCT als Mindestkriterien für MSC empfohlen werden. Zusätzlich untersuchte ich ihre CFU-Fähigkeit sowie ihre Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO)-Expression nach IFN-ɣ-Induktion, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen festgestellt wurden. Es gab jedoch einen Trend bei ihrer CFU-Fähigkeit - L-MSCs aus den mit Placebo behandelten Tieren zeigten eine höhere CFU-Fähigkeit im Vergleich zu ihren Gegenstücken, die fast keine Kolonien bilden konnten. Im Gegensatz dazu wiesen die L-MSCs der UC-MSC-behandelten Tiere nach der IFN-ɣ-Induktion eine höhere Expression von IDO auf als die der Placebo-Tiere. Darüber hinaus wiesen beide Gruppen eine höhere IDO-Expression auf, die als Mindestkriterium für die klinische Anwendung von MSC gilt. Die RNA-Sequenzierung beider Gruppen zeigte unterschiedliche exprimierte Gensätze, z.B. solche, die am Glutathion-Stoffwechsel, an Ribosomen sowie an Glykolyse und Glukoneogenese beteiligt sind. Im zweiten und wichtigsten Teil meines Projekts begann ich mit der Untersuchung und dem Vergleich verschiedener Medien für HUVECs, die auch das Wachstum und die Vermehrung von L-MSCs für direkte Ko-Kultur-Experimente unterstützen würden. Sowohl HUVECs als auch L-MSCs wurden parallel aufgetaut und zunächst in ihrem eigenen bevorzugten Zellkulturmedium kultiviert. Danach wurden sie 72 Stunden lang ko-kultiviert. Nach diesen 3 Tagen wurden die HUVECs mit Hilfe von CD31+-Magnetbeads magnetisch getrennt. Zur Qualitätskontrolle wurde einmal eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um die korrekte Abtrennung der CD31+-Zellen zu bestätigen. Danach wurden mehrere Experimente mit HUVECs durchgeführt, die mit aus der Lunge stammenden MSCs von mit Placebo behandelten Tieren (HUVECs (P)), mit HUVECs, die mit aus der Lunge stammenden MSCs von UC-MSC-behandelten Tieren (HUVECs (T)) kokultiviert wurden, und mit HUVECs ohne Ko-Kultur (HUVECs (Ctr)). Es gab keine signifikanten Unterschiede in ihren Proliferationsraten, CFU-Fähigkeiten, bioenergetischen Profilen und Fähigkeiten zur Röhrenbildung. Es gab jedoch einige sichtbare Trends. So übertrafen die HUVECs (P) beide Gegenspieler leicht in ihren Proliferationsraten und CFU-Fähigkeiten. Darüber hinaus zeigten HUVECs (P) auch besser definierte Fähigkeiten zur Vasculogenese, wenn sie auf einer künstlichen Basalmembran ausgesät wurden, sowie eine höhere Anzahl von Verzweigungen, Maschen, Fläche der Maschen usw. im Vergleich zu beiden Gegenstücken. Es gab jedoch große Diskrepanzen zwischen den Gruppen, was die Individualität der einzelnen Pavianproben unterstreicht. Auch hier ergab die RNA-Sequenzierung statistisch unterschiedlich exprimierte Gene/Gensätze, darunter viele, die am Zellzyklus, der Angiogenese und der IFN-ɣ-Reaktion beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Ergebnisse die ersten Ergebnisse von M. Möbius und Kollegen widerspiegeln, die keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen bei einer Reihe von funktionellen und strukturellen Lungenparametern feststellen konnten. Unter Berücksichtigung der Einschränkungen meiner Studie, wie der geringen Anzahl von Pavianproben, der unkonventionellen Versuchsplanung aufgrund nicht vorhandener kommerzieller Antikörper, die spezifisch für Paviane sind, sowie der makrovaskulären Endothelzellen aus dem Gewebe von Neugeborenen anstelle von mikrovaskulären Zellen, wie sie in der sich entwickelnden menschlichen Lunge vorhanden sind, ebnen meine Ergebnisse den Weg für weitere Experimente unter Verwendung der nächsten Generation menschlicher kleiner Atemwegsepithelzellen (SAECs) und den Vergleich der Ergebnisse mit HUVECs. Darüber hinaus sind eingehendere (funktionelle) Analysen mit anderen Geweben von Pavianen gerechtfertigt. So haben wir zum Beispiel begonnen, auch mit aus Trachealaspirat (TA-MSCs) gewonnenen MSCs zu arbeiten, da TA-MSCs bei Kindern mit BPD nachweislich stark vertreten sind und als Marker für BPD dienen können. Mit unseren Studien an unserem einzigartigen Modellorganismus der extremen Frühgeburtlichkeit hoffen wir, die (molekularen) pathophysiologischen Mechanismen, die der Entwicklung der BPD zugrunde liegen, besser zu verstehen und den Weg für eine sichere, robuste und wirksame stammzellbasierte Therapie der BPD zu ebnen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:92433 |
| Date | 25 July 2024 |
| Creators | Rodríguez Cabrera, Luis Alberto |
| Contributors | Rüdiger, Mario, Bornhäuser, Martin, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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