INTRODUÇÃO: A propensão do CaP em gerar metástases decorre de mecanismos moleculares específicos em um processo composto por múltiplas etapas, sendo que o remodelamento do meio extracelular através de ações de enzimas proteolíticas denominadas metaloproteinases da matriz (MMP) é uma etapa fundamental. As MMP degradam vários componentes da matriz extracelular, sendo que seu controle pode ser exercido por outras proteínas denominadas TIMPs. Em nível gênico, outro controle pode ser exercido por moléculas chamadas microRNAs. OBJETIVO: O objetivo deste estudo é avaliar a regulação da MMP-9 por miRNAs. A partir de dados da literatura identificamos que a MMP-9 pode sofrer influência do miR-21 e 338-3p. MÉTODOS: Para os experimentos in vitro, linhagens celulares de CaP (DU145, PC3 e LNCaP) foram transfectadas com os miRNAs de interesse e a expressão de MMP-9 foi avaliada por reação em cadeia de polimerase quantitativa com transcriptase reversa (qRT-PCR). O sobrenadante da transfecção foi usado para ensaios de invasão com matrigel, e ELISA. Nos experimentos in vivo, células da linhagem PC-3-luc foram implantadas no subcutâneo de camundongos Balb-c nude e tratadas com injeções de anti-miR-21, miR-338-3p ou a combinação de ambos. RESULTADOS: O miR-21 aumentou expressão de MMP-9 em 72% na PC3. Houve maior invasão celular tanto na PC3 como DU145. In vivo, o bloqueio do miR-21 reduziu em 10% a expressão de MMP-9 nos tumores implantados (p=0,04). O miR-338-3p reduziu a expressão de MMP-9 em 53% na PC3 (p=0,001), 31% na LnCaP (p=0,23) e 24% na DU145 (p=0,16). No ensaio de invasão, menor número de células e colônias foram capazes de invadir a membrana de matrigel. In vivo, houve redução de 27% na expressão de MMP-9 nos camundongos tratados com o miR-338-3p (p=0,07). A combinação anti-miR-21+miR-338-3p reduz a expressão de MMP-9 em maior intensidade tanto in vitro como in vivo. CONCLUSÕES: A expressão de MMP-9 pode ser regulada pelo miR-21 e miR-338-3p. O primeiro se comporta como um oncomiR ao passo que o segundo como um supressor tumoral. A combinação de miRNAs é uma estratégia plausível para ampliar o efeito sobre expressão de genes de interesse / INTRODUCTION: The propensity of CaP to generate metastases results from specific molecular mechanisms in a multiphase process and the remodeling of the extracellular medium through the actions of proteolytic enzymes called matrix metalloproteinases (MMP) is a fundamental step. MMPs degrade several components of the extracellular matrix, and their control can be exerted by other proteins called TIMPs. At the gene level, another control can be exerted by molecules called microRNAs. OBJECTIVE: The objective of this study is to evaluate the regulation of MMP-9 by miRNAs. From literature data we have identified that MMP-9 may be influenced by miR-21 and 338-3p. METHODS: For in vitro experiments, CaP cell lines (DU145, PC3 and LNCaP) were transfected with the miRNAs of interest and the expression of MMP-9 was assessed by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR). The transfection supernatant was used for matrigel and ELISA invasion assays. For the in vivo experiments, PC3-luc cells were implanted into the subcutaneous Balb-c nude mice and treated with anti-miR-21, miR-338-3p injections or the combination of both. RESULTS: The miR-21 increased MMP-9 expression by 72% in PC3. There was greater cell invasion in both PC3 and DU145. In vivo, miR-21 blockade reduced MMP-9 expression by 10% in implanted tumors (p = 0.04). MiR-338-3p reduced MMP-9 expression by 53% in PC3 (p = 0.001), 31% in LNCaP (p = 0.23), and 24% in DU145 (p = 0.16). In the invasion assay, fewer cells and colonies were able to invade the matrigel membrane. In vivo, there was a 27% reduction in MMP-9 expression in mice treated with miR-338-3p (p = 0.07). The combination of anti-miR-21 + miR-338-3p reduces MMP-9 expression in greater intensity both in vitro and in vivo. CONCLUSIONS: MMP-9 expression can be regulated by miR-21 and miR-338-3p. The former behaves as an oncomyR while the second as a tumor suppressor. The combination of miRNAs is a plausible strategy to extend the effect on gene expression of interest
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-15012019-073514 |
| Date | 05 October 2018 |
| Creators | Ivanovic, Renato Fidelis |
| Contributors | Faria, Sabrina Thalita dos Reis |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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