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Previous issue date: 2011-04-01 / A enzima guanosina monofosfato (GMP) redutase catalisa a deamina??o redutiva do GMP ? inosina monofosfato (IMP). GMP redutase possui um papel importante na convers?o dos nucleos?deos e nucleot?deos derivados de guanina a nucleot?deos de adenina. Al?m desse fato, como parte da via de salvamento de purinas, tamb?m participa da reutiliza??o de bases livres intracelulares. Nesse trabalho, mostramos a clonagem, a express?o e a purifica??o da GMP redutase codificada pelo gene guaC de Escherichia coli a fim de determinar seu mecanismo cin?tico; bem como as caracter?sticas qu?micas e termodin?micas da rea??o catalisada. Estudos de velocidade inicial e titula??o de calorimetria isot?rmica demonstraram que a GMP redutase possui um mecanismo cin?tico bi-bi ordenado, no qual o GMP liga primeiro ? enzima, seguido pela liga??o do NADPH; o NADP+ se dissocia primeiro, seguido pela libera??o do IMP. A titula??o calorim?trica tamb?m mostrou que a liga??o do GMP e IMP s?o processos termodinamicamente favor?veis. Perfis de pH demonstraram grupos com valores de pK aparentes de 6,6 e 9,6 envolvidos na cat?lise, valores de pK de 7,1 e 8,6 importantes para liga??o do GMP e um valor de pK de 6,4 importante para liga??o do NADPH. Efeito isot?pico prim?rio demonstrou que a transfer?ncia do hidreto contribui para a etapa limitante da rea??o, enquanto que os efeitos isot?picos do solvente prov?m de um ?nico local de protona??o que possui um papel modesto na cat?lise. Efeito isot?pico m?ltiplo sugere que as etapas de protona??o e transfer?ncia do hidreto ocorrem no mesmo estado de transi??o, fornecendo evid?ncia de um mecanismo concerted. Os dados de cin?tica em estado pr?-estacion?rio indicam que a libera??o do produto n?o contribui para a etapa limitante da rea??o catalisada pela GMP redutase de E. coli. Em conjunto, os resultados mostram que a rea??o catalisada pela GMP redutase segue um mecanismo sequencial e ordenado, onde a transfer?ncia do hidreto e do pr?ton ocorrem no mesmo estado de transi??o. Os resultados aqui apresentados foram os primeiros a evidenciar o mecanismo cin?tico da GMP redutase, bem como, os res?duos fundamentais para cat?lise e/ou liga??o, al?m de fornecer informa??es sobre o estado de transi??o da rea??o
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.pucrs.br:tede/5388 |
| Date | 01 April 2011 |
| Creators | Martinelli, Leonardo Kr?s Borges |
| Contributors | Santos, Di?genes Santiago |
| Publisher | Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul, Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, BR, Faculdade de Bioci?ncias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8198246930096637360, 600, 600, 36528317262667714 |
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