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Previous issue date: 2014-03-31 / The mycobacterial DNA-binding protein 2 (MDP2) of Mycobacterium tuberculosis is a small, basic protein known to bind to DNA in a non-specific manner and to anchor the nucleoid to the plasma membrane, promoting its unpacking. Motivated by a prior intrinsic disorder pre-diction in silico, we have used a complementary set of techniques to characterize this pro-tein, such as heat and chemical stability, gel filtration, limited proteolysis and electrophoret-ic mobility. Our results suggest that the MDP2 is structurally disordered, since it (1) was pre-dicted to be an IDP, having 86 % of its structure disordered; (2) resisted to denaturation in-duced by boiling temperature and to the chemical thrichloroacetic acid (TCA); (3) migrated anomalously on SDS-PAGE, appearing to be 1.4-fold higher its calculated molecular weight; and (4) was highly sensitive to proteolysis performed by proteinase K in comparison to glob-ular proteins. We also accomplished two experiments to determine the quaternary structure of the MDP2, such as gel-filtration and glutaraldehyde crosslinking. These two experiments showed that the protein has a tendency of self-aggregation, forming large clusters of pro-tein. We also performed the site-directed mutagenesis by allelic exchange in the hns gene, in order to develop a M. tuberculosis strain lacking the protein MDP2. The result of this knock-out showed that the hns gene is not essential for the survival of the mycobacteria, confirm-ing previous results performed by transposon mutagenesis. Combined with previous results related to MDP2 from other works, we speculate that this protein uses its highly disorder N-terminal region to bind to DNA through its KAAK and PAKK sequences in a non-specific man-ner. Thereby the MDP2 may act as a promiscuous protein inside the cell, binding to different regions of nucleoid by forming large clusters of proteins, in order to perform the DNA un-packing and to regulate several genes of the mycobacteria. We hope this work may contrib-ute to a better understanding of the mycobacterial metabolism, since the M. tuberculosis still stands a major global threat. / A prote?na micobacteriana ligadora de DNA 2 (MDP2) de Mycobacterium tuberculosis ? uma prote?na pequena e de car?ter b?sico, conhecida por se ligar ao DNA de uma forma n?o es-pec?fica e de ancorar o nucle?ide ? membrana plasm?tica promovendo o seu desempacota-mento. Motivados por uma predi??o de desordem intr?nseca in silico pr?via, n?s usamos um conjunto de t?cnicas complementares para caracterizar esta prote?na, tais como determina-??o da estabilidade ao calor e a desnaturantes qu?micos, gel filtra??o, prote?lise limitada e mobilidade eletrofor?tica. Nossos resultados sugerem que a MDP2 ? estruturalmente de-sordenada, uma vez que ela (1) foi predita por ser uma prote?na intrinsecamente desorde-nada (IDP), possuindo 86 % da sua estrutura desordenada; resistiu ? desnatura??o induzida por temperatura de fervura e pela a??o qu?mica do ?cido tricloroac?tico (TCA); (3) migrou anomalamente em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), aparentando ser 1,4 vezes maior que o seu peso molecular calculado; e (4) foi altamente sens?vel ? prote?lise realizada pela protei-nase K, em compara??o ?s prote?nas globulares. N?s tamb?m realizamos dois experimentos para determinar a estrutura quatern?ria da prote?na, como a gel filtra??o e o crosslinking por glutaralde?do. Estes dois experimentos mostraram que a prote?na tem uma tend?ncia a auto agrega??o, formando grandes aglomerados em solu??o. Tamb?m foi realizada a muta-g?nese s?tio-dirigida por troca al?lica no gene hns, com o intuito de desenvolver uma cepa de M. tuberculosis sem a prote?na MDP2. O resultado deste nocaute mostrou que o gene hns n?o ? essencial para a sobreviv?ncia da micobact?ria. Combinado com resultados pr?vios de outros trabalhos relacionados ? MDP2, n?s especulamos que esta prote?na usa sua regi?o N-terminal altamente desordenada para se ligar ao DNA por meio das suas sequ?ncias repetiti-vas KAAK e PAKK de uma forma n?o espec?fica. Desta forma, a MDP2 deve atuar como uma prote?na prom?scua dentro da c?lula, ligando-se a diferentes regi?es do nucle?ide pela for-ma??o de grandes aglomerados de prote?na, com o objetivo de realizar o desempacotamen-to do DNA e de regular diversos genes micobacterianos. N?s esperamos que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento do metabolismo micobacteriano, uma vez que o M. tuberculosis ainda ? uma grande amea?a global.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.pucrs.br:tede/5491 |
| Date | 31 March 2014 |
| Creators | Abbadi, Bruno Lopes |
| Contributors | Bizarro, Cristiano Valim |
| Publisher | Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul, Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, BR, Faculdade de Bioci?ncias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8198246930096637360, 600, 600, 36528317262667714 |
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