Septinas abrangem uma família conservada de proteínas que ligam e hidrolisam GTP e formam heterofilamentos, anéis e redes para realizar as suas funções. Apresentam três domínios estruturais: o domínio N-terminal contendo uma sequência polibásica (para ligar membranas), o domínio de ligação ao nucleotídeo (G) e o domínio C-terminal que inclui uma sequência predita de formar um coiled-coil. Em humanos, as 13 septinas são classificadas em quatro grupos (I, II, III e IV) baseadas nas sequências de aminoácidos. O único filamento caracterizado estruturalmente, até hoje, é o formado por SEPT2-SEPT6-SEPT7, mostrando que as subunidades interagem através de duas interfaces (chamadas G e NC). Os determinantes estruturais da montagem correta do filamento são pouco conhecidos, sendo o estudo limitado pela complexidade em purificar e cristalizar complexos triméricos ou tetraméricos. Uma abordagem alternativa é estudar interfaces individuais de um filamento (G e/ou NC) por separado. Assim, o presente projeto objetivou estudar, utilizando uma abordagem biofísica e estrutural, a interface G formada por SEPT5 e SEPT8 para elucidar os fatores importantes em determinar a sua especificidade. Os domínios GTPase de SEPT5 e SEPT8 foram clonadas em vetor de expressão bicistrônico pET-Duet, co-expressas e co-purificadas. Estudos de análise do estado oligomérico e homogeneidade foram conduzidos utilizando cromatografia de exclusão molecular, espalhamento dinâmico de luz e ultracentrifugação analítica, revelando um complexo dimérico e monodisperso. O complexo apresenta uma mistura aproximadamente equimolar de nucleotídeos (GTP e GDP) ligados enquanto SEPT8(G) sozinha é incapaz de ligar qualquer um dos dois. Além disto o complexo apresenta uma termoestabilidade maior que SEPT8(G), verificado por um aumento em Tm de 5°C. Com o intuito de observar os determinantes estruturais da especificidade, ensaios de cristalização foram conduzidos e assim, cristais do complexo SEPT5-SEPT8(G) que difrataram apenas a muito baixa resolução foram obtidos. Na ausência de uma estrutura cristalográfica, modelagem por homologia foi realizada para analisar as interfaces G entre diferentes combinações de septinas. Identificamos uma interação entre aminoácidos característicos (aminoácidos únicos para cada grupo de septinas) para o complexo formado entre membros do grupo III, (incluindo SEPT5) e membros do grupo II, (incluindo SEPT8). Esta interação entre Phe131 (grupo III) e Thr19 (grupo II) pode explicar a especificidade na formação de uma interface G entre septinas destes grupos durante a formação do filamento e além disso, a importância da presença do GTP ligado ao septina do grupo II. Com isto, propomos pela primeira vez uma explicação plausível da relevância da perda de atividade catalítica das septinas deste grupo, um fato inexplicado até o momento. Mutação dos resíduos identificados levou a uma mudança no seu perfil de eluição do complexo durante purificação por exclusão molecular indicando alterações na formação do complexo mutante. / Septins are a conserved family of proteins that bind and hydrolyze GTP and form heterofilaments, rings and networks in order to carry out their functions. They have three structural domains: an N-terminal domain containing a polybasic sequence (for membrane binding), a nucleotide-binding (G) domain and a C-terminal domain including a sequence predicted to form a coiled-coil. In humans, 13 septins have been classified into four groups (I, II, III and IV) based on their amino acid sequences. The only structurally characterized filament described to date is formed by SEPT2-SEPT6-SEPT7, which reveals that the subunits interact through two different interfaces (G and NC). The structural determinants of correct filament assembly are poorly known, and this is limited by the complexity of purifying and crystallizing trimeric or tetrameric complexes. An alternative approach is to study a single filament interface (G or NC) on its own. Here, we aimed to study, using biophysical and structural approaches, the G interface formed between SEPT5 and SEPT8 to elucidate the factors relevant to determining its specificity. The GTPase domain of SEPT5 and SEPT8, were cloned into the bicistronic expression vector pET-Duet, co-expressed and co-purified. Studies to determine the oligomeric state and homogeneity of the complex were conducted using size exclusion chromatography, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation, revealing a monodisperse dimer for SEPT5-SEPT8(G). The complex elutes with an approximately equimolar mixture of bound nucleotides (GTP and GDP) whereas SEPT8(G) alone is shown to be unable to bind either. Furthermore, the complex has a greater thermostability than SEPT8(G), demonstrated by an increase of 5°C in Tm. In order to determine the structural determinants of specificity, crystallization trials were conducted and crystals of the SEPT5-SEPT8(G) complex were obtained, but these diffracted to only very low resolution. In the absence of a crystal structure, homology modeling was performed to analyze the potential G interfaces between different septin combinations. An interaction between characteristic amino acids (those which are unique to given septin group) was identified for the complex formed between group III septins (including SEPT5) and group II septins (including SEPT8). This interaction, between Phe131 (group II) and Thr19 (group III) may explain the specificity in the formation of a G interface between septins of these groups during filament formation and furthermore the importance of GTP bound to the group II septin. These observations allow us to propose for the first time a plausible explanation for relevance of the loss of catalytic activity by this septin group, an unexplained fact up until now. Mutation of the identified residues resulted in a change in the elution profile of the complex from the size exclusion column suggesting structural alterations in the mutants.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-27102016-102703 |
| Date | 27 June 2016 |
| Creators | Diego Antonio Leonardo Cabrejos |
| Contributors | Richard Charles Garratt, Sandro Roberto Marana, Flávio Henrique da Silva |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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