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Previous issue date: 2012-02-29 / CAPES / A infecção persistente por tipos oncogênicos de Papilomavírus Humano (HPV) é necessária
para o desenvolvimento do câncer cervical e para uma grande porcentagem de outros tumores
anogenitais e orofaríngeos. Desde que essas doenças têm como agente etiológico um vírus, a
vacinação profilática representa uma intervenção barata, efetiva e logisticamente simples. A
proteína L1 do capsídeo viral é capaz de arranjar-se em partículas morfologicamente e
antigenicamente semelhantes ao vírus denominadas Virus-like particles (VLPs), abordagem
esta utilizada pelas vacinas anti-HPV atualmente licenciadas. Apesar da eficácia comprovada,
a implementação dessas vacinas é um desafio devido à desconhecida duração da proteção por
elas conferida, o elevado custo atrelado e a possibilidade de outros tipos virais carcinogênicos
emergirem. O sistema de expressão baseado em Pichia pastoris tem sido explorado para
produção de VLPs de HPV, mas os níveis de expressão relatados têm sucesso variado e todos
os trabalhos empregam vetores comerciais baseados no promotor induzível do gene AOX1
(PAOX1). No presente trabalho, avaliamos a produção extracelular da proteína L1 de HPV-16
em P. pastoris, mediante utilização dos sistemas baseados no promotor PAOX1 e no promotor
constitutivo do gene PGK1 (PPGK1). Linhagens de P. pastoris recombinantes foram geradas
mediante eletroporação com os cassetes de expressão pPICZAα-L1H16 e pPGK 3-L1H16.
Clones contendo múltiplas cópias de cada cassete foram selecionados por ensaios de
resistência à ZeocinaTM e triados quantos aos níveis de expressão mediante Colony blotting e
Dot blotting, utilizando anticorpo anti-L1 (CamVir®). Embora tenha se observado aparente
degradação e glicosilação da proteína L1, os resultados obtidos por Western blotting a partir
das induções em frasco revelaram que o sistema baseado no promotor PPGK1 apresentou
maiores níveis de expressão do que àquele baseado no promotor PAOX1. A tentativa de
purificação da proteína L1 com resina de afinidade se mostrou insatisfatória, possivelmente
devido à problemas conformacionais na cauda de poli-histidina. Esses resultados representam
análises preliminares passíveis de otimização. Os eventos de glicosilação precisam ser
confirmados por análises mais detalhadas. Metodologias alternativas para purificação das
VLPs estão sendo avaliadas, bem como estratégias de cultivo para minimizar a proteólise de
L1. O presente trabalho demonstra que o sistema não comercial baseado no promotor
constitutivo do gene PGK1 de P. pastoris representa uma atrativa plataforma para produção
de VLPs de HPV com fins vacinais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/12506 |
| Date | 29 February 2012 |
| Creators | Mariz, Filipe Colaço |
| Contributors | Freitas, Antonio Carlos de |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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