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Previous issue date: 2007-03-23 / Hepatitis C is considered one of the largest problems of public health in the
world, inclusively in Brazil, whereas a preventive vaccine none is available; the number
of asymptomatic infections is elevated and for control of the disease, there exist only
imported kits. Considering, principally, the increase of preoccupation with the detection
of precocious hepatitis C and that the diagnostic methods of this infection are of the
highest clinical importance, the presence study proposes the expression and the
purification of one codified protein through a synthetic gene (MEHCV Multiepitope
HCV). To achieve this objective, the new recombinant protein multiepitope was
designed on the basis of epitopes linear, immunodominant and phylogenetically
conserved from the virus of hepatitis C (HCV), including the immune dominating
sequences of the genotypes that are more prevalent in Brazil (1a e 3a) and a His-tag in
C-terminal to facilitate the purification of the recombinant protein express in bacteria.
These epitopes (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) are considered among the most
important for the diagnosis of the illness utilized for many HCV detection tests. The
MEHCV gene (~720pb) possesses restrictive of sites (NdeI e XhoI) in yours extremities
that permits the clonage in phase in the expression of vector bacterial pET-21a. To the
synthesize of this gene was made the optimization to the codon usage of E. coli. The
protein of interest (~29kDa) was detected by SDS-PAGE and Western blot. The
purification of the protein express was realized by centrifugal in resin Ni-NTA by
affinitive chromatography. Inasmuch as the purification was not total, a new
purification was made of this protein by means of chromatography of affinity in column
with resin Ni-NTA. However, did not having this purification owe a presence of cellular
proteins. In such case, in the trial of obtain a total purification of this protein
multiepitope, would be interesting the utilization of the one new protocol, with the
extraction of the inclusion body, wherein all the dissolvable proteins cellular would be
remove of the solution. / A hepatite C é considerada um dos maiores problemas de saúde pública no
mundo inteiro, inclusive no Brasil, pois uma vacina preventiva não está disponível, o
número de infectados com a forma assintomática é elevado e para o controle da doença,
há somente kits importados. Considerando, principalmente, o aumento da preocupação
com a detecção precoce da hepatite C e que os métodos de diagnóstico desta infecção
são de grande relevância clínica, o presente trabalho propõe a expressão e purificação de
uma proteína codificada por um gene sintético (MEHCV Multiepítopo HCV). Para
atingir este objetivo, uma proteína multiepítopo recombinante foi desenhada a partir de
epítopos lineares, imunodominantes e filogeneticamente conservados do vírus da
hepatite C (HCV), com a inclusão de seqüências imunodominantes dos genótipos mais
prevalentes no Brasil (1a e 3a) e uma His-tag no C-terminal para facilitar a purificação
da proteína recombinante expressa em bactéria. Estes epítopos (core, NS3, NS4A,
NS4B e NS5) são considerados entre os mais importantes para o diagnóstico da doença
e utilizados em muitos testes para detecção do HCV. O gene MEHCV (~720pb) possui
sítios de restrição (NdeI e XhoI) nas suas extremidades que permitem a clonagem em
fase no vetor de expressão bacteriano pET-21a. Para a síntese deste gene, foi feita a
otimização para o códon usage de E. coli. A proteína de interesse (~29kDa) foi
detectada por SDS-PAGE e Western blot. A purificação da proteína expressa foi
realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA. Como a purificação não foi
total, foi feita uma nova purificação desta proteína por cromatografia de afinidade em
coluna com resina Ni-NTA. No entanto, não houve esta purificação devido à presença
de proteínas celulares. Sendo assim, na tentativa de alcançar a purificação total desta
proteína multiepítopo, seria interessante a utilização de um novo protocolo, com a
extração dos corpos de inclusão, onde todas as proteínas celulares solúveis seriam
retiradas da solução.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:ambar:tede/3075 |
| Date | 23 March 2007 |
| Creators | Castro, Marielle de Oliveira |
| Contributors | Pfrimer, Irmtraut Araci Hoffmann, Torres, Fernando Araripe Gonçalves |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Ciências Ambientais e Saúde, PUC Goiás, BR, Ciências da Saúde |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_GOAIS, instname:Pontifícia Universidade Católica de Goiás, instacron:PUC_GO |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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