Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2006. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-12-01T13:59:23Z
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Previous issue date: 2006 / O prion é uma proteína de superfície de membrana, presente no tecido nervoso da maioria dos mamíferos. É uma proteína de tamanho médio (250 resíduos de aminoácidos em sua estrutura primária) e que ainda possui sua função biológica indefinida, apesar de diversos estudos já realizados. O prion é responsável por um conjunto de doenças chamadas Encefalopatias Espongiformes, onde se incluem a Síndrome de Creutzfeld-Jacob e a Encefalopatia Espongiforme Bovina (Mal da vaca Louca). Estas patologias podem estar relacionadas a eventos de mudança conformacional que ocorrem na proteína durante o transporte de íons cobre para o neurônio. Estudos realizados na última década comprovaram a existência de uma interação entre o prion e íons cobre(II), que ocorre em regiões definidas do prion: entre os resíduos de aminoácidos 60 e 91, e possivelmente entre os resíduos de aminoácidos 92 e 96 e 180 e 193. Diversas técnicas analíticas têm sido utilizadas para o estudo da interação cobre - prion (EPR, RMN, espectrometria de massa, espctroscopia CD-UV, Raman), no entanto ainda existe uma carência de dados e uma divergência de resultados no que se refere aos parâmetros quantitativos. Neste trabalho, utilizou-se a voltametria de redissolução anódica para estudar a interação do prion com os íons cobre (II). Inicialmente, fragmentos peptídicos, correspondentes aos sítios de ligação do cobre no prion (PHGGGWGQ: resíduos 60 a 91; GGGTH: resíduos 92 a 96; VNITKQHTVTTTT: resíduos 180 a 193), foram sintetizados pelo método Fmoc de fase sólida. Em seguida, realizou-se a clivagem dos peptídeos da resina e a remoção de seus grupos protetores com reagentes orgânicos. Os peptídeos foram posteriormente purificados utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e padronizados por espectroscopia UV-Vis utilizando a Lei de Beer e os métodos de Edelhoch e Murphy & Kies. A espectrometria de massa foi utilizada para a identificação e verificação da pureza (determinação da massa molecular e seqüência) dos peptídeos. Para todos os peptídeos estudados, observou-se a formação de um complexo com os íons cobre(II). A estequiometria da reação de complexação do Cu2+ com os peptídeos foi de 1 mol de peptídeo para 1 mol de íon cobre(II), em todos os sistemas estudados, estando em concordância com a literatura. Duas metodologias foram utilizadas para o cálculo da constante de dissociação (Kd) dos complexos: Lei da Ação das Massas (Kd = 4,371 x 10-8 mol L-1 - complexo Cu2+-Ac-VNITKQHTVTTTT-NH2; Kd= 4,334 x 10-8 mol L-1 - complexo Cu2+-Ac-GGGTH-NH2 e Kd = 5,240 x 10-9 mol L-1 - complexo Cu2+-Ac-PHGGGWGQ-NH2) e Titulação Amperométrica (Kd = 2,683 x 10-9 mol L-1 - complexo Cu2+-Ac-VNITKQHTVTTTT-NH2; Kd= 1,830 x 10-9 mol L-1 - complexo Cu2+-Ac-GGGTH-NH2 e Kd = 3,500 x 10-10 mol L-1 - complexo Cu2+-Ac-PHGGGWGQ-NH2), Com base nestes resultados, foi proposto um mecanismo para explicar a participação dos íons cobre(II) nos eventos de mudança conformacional característicos das síndromes. Os íons cobre(II) que se ligam ao prion na região entre os resíduos 60 e 91 (complexo mais estável) teriam participação direta na mudança conformacional, enquanto que os íons cobre(II) que se ligam às outras regiões do prion (resíduos 92 a 96 e 180 a 193) atuariam no papel biológico da proteína, que consiste em transportar íons cobre até enzimas que previnem danos oxidativos nos neurônios. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Prion is a protein of membrane surface, which is present in the majority
of the mammalians. It is a protein of average size (250 amino acid residues in
its primary structure) that still has its biological function unclear, although many
studies have been already done. Prion is responsible for a group of diseases
called Spongiforms Encefalopaties, such as Creutzfeld-Jacob Disease and
Bovine Spongiform Encefalopaty (Mad Cow Disease). The occurrence of these
diseases can be related to conformational changes that occur in the structure of
the protein during the transport of copper ions to neurons. Many studies, which
have been carried out in the last decade, demonstrated that there is an
interaction between prion and copper(II) ions, that occurs at certain peptide
fragments of prion: between 60 and 91 amino acids residues and possibly
between 92 and 96 and 180 and 193 amino acids residues Many analytical
techniques have been used to study the interaction between copper and prion
(EPR, RMN, mass spectrometry, CD-UV spectroscopy, Raman). However, the
quantitative data obtained in the studies differ significatively and there is still
many information about the interaction that remains unclear. In this work, the
anodic stripping voltammetry was used to study the interaction between copper
(II) ions and prion. Initially, peptide fragments, which correspond to cooper
binding sites at prion (PHGGGWGQ: 60 to 91 amino acid residues; GGGTH: 92
to 96 amino acid residues; VNITKQHTVTTTT: 180 to 193 amino acid residues),
were synthesized by Fmoc-solid phase method. Then, the peptides were
cleaved from the resin and its protecting groups removed with organic reagents.
The peptides were then purified by reverse phase high performance liquid
chromatography and their concentrations were determined by UV-Vis
spectroscopy using the beer law, and Edelhoch and Murphy & Kies methods.
Mass spectrometry was used to identify and characterize the peptides
(molecular mass and amino acid sequence determination). The formation of a
complex with cooper(II) ions was observed for all the three studied peptides.
The stoichiometry rate was found to be 1 mol of peptide to 1 mol of Cu2+ ion for
all the three studied systems. These obtained values are in agreement with
literature. Two methodologies were used to determine the dissociation constant
(Kd) of the complexes: Action Law Mass (Kd = 4.371 x 10-8 mol L-1 – Cu2+-Ac-
VNITKQHTVTTTT-NH2 complex; Kd = 4.334 x 10-8 mol L-1 – Cu2+-Ac-GGGTHNH2
complex and Kd = 5.240 x 10-9 mol L-1 – Cu2+-Ac-PHGGGWGQ-NH2
complex) and Amperometric Titration (Kd = 2.683 x 10-9 mol L-1 - Cu2+-Ac-
VNITKQHTVTTTT-NH2 complex; Kd = 1.830 x 10-9 mol L-1 - Cu2+-Ac-GGGTHNH2
complex and Kd = 3.500 x 10-10 mol L-1 - Cu2+-Ac-PHGGGWGQ-NH2
complex). Based on these results, a mechanism was proposed to explain the
involvement of copper(II) ions in the conformational change events that are
observed in the occurence of the Spongiforms Encefalopaties. The copper(II)
ions, which bind to the fragment between 60 and 91 amino acid residues (more
stable complex), would have direct participation in the conformational changes,
while the copper(II) ions, which bind to the others fragments in the prion (92 to
96 and 180 to 193 amino acid residues) would act in the biological function of
the protein, that is to transport the copper(II) ions to anti-oxidative enzymes in
the neurons.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/2747 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Oliveira Filho, Waldemar Pacheco |
| Contributors | Castro, Clarissa Silva Pires de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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