Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / En nuestro país, la necrosis pancreática infecciosa (IPN) es una enfermedad endémica, prevalente y de importancia económica, ya que está ampliamente distribuida en las salmoniculturas chilenas. El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) pertenece a la familia Birnaviridae, género Aquabirnavirus. Se caracteriza por no tener envoltura lipídica y un diámetro cercano a los 60 nm. Su genoma está compuesto por dos segmentos de RNA de doble hebra, segmento A y B. Los extremos 5’ de cada segmento tienen unida covalentemente la proteína viral Vpg de 94 kDa. El RNA mensajero (mRNA) no posee cola de poliadenina o CAP. Se ha demostrado que la infección viral inhibe la síntesis de proteínas celulares a la vez que los polipéptidos virales comienzan a ser detectados, por ello se espera que el mecanismo de inicio de la traducción viral sea diferente al de la célula huésped. Si bien se han realizado estudios que buscan entender dicho fenómeno, no se ha descrito qué proteína viral podría ser la responsable de éste. Basado en estos antecedentes, en este seminario de título se buscó evaluar el efecto de la infección viral y la contribución particular de las proteínas virales VP1, pVP2, VP2 y VP4 en la traducción de los mRNAs reporteros cuya traducción fuera dependiente de CAP o del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Para ello se evaluó la expresión de reporteros bicistrónicos (dual luc o dL) que contienen los IRES del virus de la parálisis de Cricket (CrPV) y del virus de la hepatitis C (HCV). Se utilizó la línea celular derivada de células embrionarias de Lepomis macrochirus, CHSE/F, las cuales son susceptibles a la infección de IPNV. Las células fueron infectadas o transfectadas con plasmidios codificantes de las proteínas virales. Para los experimentos de transfección se utilizaron plasmidios codificantes para VP1 y VP4 con los que ya se contaba en el laboratorio y se generaron, por clonamiento bacteriano, plasmidios codificantes de la proteína estructural VP2 y su precursora pVP2. Estos vectores bacterianos fueron evaluados mediante PCR
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e inmunofluorescencia.
En el experimento de infección de células CHSE/F se observó una disminución de la traducción CAP dependiente y un aumento de la traducción IRES dependiente.
Por otra parte, en el experimento de transfección se registró que VP1 y VP4 inhiben la traducción CAP dependiente y estimulan la traducción IRES dependiente. En el caso de los ensayos realizados con VP2 y pVP2, en presencia de la proteína estructural precursora la traducción CAP dependiente disminuyó a la mitad, mientras que al transfectar VP2 no hubo cambios significativos. Los resultados respecto a la traducción IRES dependiente, en presencia de las proteínas estructurales son poco claros - con pVP2 no se reportaron cambios significativos, y con VP2 la traducción aumentó para 1 de los reporteros (dlCrPV), mientras que disminuyó para el otro (dlHCV). Estos resultados muestran que las proteínas virales afectan de distinta manera la traducción de los mRNAs, lo que sugiere que son estas las responsables de la inhibición de la traducción CAP dependiente y de la estimulación de la traducción IRES dependiente. / In our country, infectious pancreatic necrosis (IPN) is an endemic, prevalent and economically important disease that is widely distributed in Chilean salmon farms. The infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) belongs to the family Birnaviridae, genus Aquabirnavirus. It is characterized by having no lipid envelope and a diameter close to 60 nm. Its genome is composed of two segments of double-stranded RNA, segment A and B. The 5 'ends of each segment is covalently linked to the viral protein Vpg of 94 kDa. The messenger RNA (mRNA) does not have a polyadenine tail or CAP. It has been shown that viral infection inhibits the synthesis of cellular proteins at the same time that viral polypeptides begin to be detected, therefore it is expected that the mechanism of viral translation initiation will be different from that of the host cell. Although there have been studies that seek to understand this phenomenon, it has not been described what viral protein could be responsible for it. Based on this background, this title seminar aimed to evaluate the effect of viral infection and the particular contribution of viral proteins VP1, pVP2, VP2 and VP4 in the translation of reporter mRNAs whose translation was dependent on CAP or the internal ribosome entry site (IRES). To this end, the expression of bicistronic reporters (dual luc or dL) containing the IRES of the Cricket palsy virus (CrPV) and the hepatitis C virus (HCV) was evaluated. The cell line derived from Lepomis macrochirus embryonic cells, CHSE / F, which is susceptible to IPNV infection was used. The cells were infected or transfected with plasmids coding for the viral proteins. For the transfection experiments, plasmids coding for VP1 and VP4 that were used were those already counted in the laboratory and plasmids coding for the structural protein VP2 and its pVP2 precursor was generated by bacterial cloning. These bacterial vectors were evaluated by PCR and immunofluorescence.
In the CHSE / F cell infection experiment, a decrease in CAP-dependent translation and
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an increase in IRES-dependent translation was observed.
On the other hand, with the transfection experiment it was recorded that VP1 and VP4 inhibit the CAP-dependent translation and stimulate the IRES-dependent translation. In the case of the tests carried out with VP2 and pVP2, in the presence of the precursor structural protein, the CAP dependent translation decreased by half, whereas when transfecting VP2 there were no significant changes. The results regarding IRES dependent translation, in the presence of structural proteins are unclear. With pVP2 no significant changes were reported, and with VP2 the translation increased for 1 of the reporters (dlCrPV), while it decreased for the other (dlHCV). These results show that viral proteins affect the translation of mRNAs in different ways, suggesting that they are responsible for the inhibition of CAP dependent translation and the stimulation of IRES-dependent translation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/150613 |
| Date | 07 1900 |
| Creators | Cárcamo Cárcamo, Fernanda Ayesha Belén. |
| Contributors | Rivas Aravena, Andrea, González Catrilelbún, Sebastián, Utreras Puratich, Elías, Universidad de Chile. Facultad de Ciencias. Escuela de Pregrado. |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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