A desnutrição pode induzir lesão celular, comprometendo os mecanismos envolvidos de proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição protéica e protéico-energética, hipoplasia medular com evidências histológicas de alteração da matriz extra celular. Nosso objetivo foi avaliar a eventual participação dos processos de apoptose, necrose e autofagia no desenvolvimento da hipoplasia medular observada nesse modelo. Para isso foram utilizados dois grupos de camundongos C57BL/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos. O grupo controle (C) recebeu ração normoproteíca contendo 12% de proteína e o grupo desnutrido (D), alimentado com ração hipoprotéica contendo 2% de proteína. A fonte protéica utilizada foi a caseína. O período de indução da desnutrição foi cerca de cinco semanas, definido pela perda de 20 a 25 % de peso corpóreo por parte dos animais do grupo desnutrido. Após esse período, os animais de ambos os grupos foram anestesiados e realizada a coleta das amostras biológicas para avaliação nutricional e hematológica e coletadas células da medula óssea para avaliação da apoptose, necrose e autofagia. Para avaliação da apoptose e necrose as células foram duplamente marcadas com Annexina V, PI e caspase 3 que foram analisadas por citometria de fluxo . A expressão da protéina BCL-2 foi quantificada pela técnica de Western Blotting. A análise não demonstrou diferença estatística entre os grupos para esses parâmetros. Para avaliação da autofagia extraiu-se proteínas das células da medula óssea e avaliou-se a expressão das proteínas Akt e mTOR total e fosforilado , os complexos de mTor (Raptor, Rictor e Gβl) , Beclin-1 e LC3II. Os resultados demonstraram aumento significativo de mTOR total ,Raptor , Beclin-1 e LC3II e diminuição na fosforilação de mTOR nas células oriundas de animais desnutridos em relação ao grupo controle. A desnutrição não modificou a expressão de Akt total, porém houve diminuição da fosforilação de Akt e diminuição na expressão das proteínas Rictor e Gβl nas células analisadas. Como os processos apoptóticos e autofágicos podem ser de difícil detecção in vivo, também refizemos os experimentos in vitro, estimulando as células com compostos pró-apoptóticos (campotecina) e pró-autofágicos (tamoxifeno). Nesses experimentos observamos que, apenas quando estimulamos as células de animais desnutridos com camptotecina, as mesmas, no período de 12 horas apresentaram maior percentagem de apoptose inicial em relação a 0 horas , sugerindo que há um período em que as células desnutridas são sinalizadas para via apoptótica sendo mais susceptível ao estimulo. As células de animal desnutrido estimulado apresentaram após 12 horas aumento significativo da apoptose tardia em relação ao controle estimulado , indicando que nesse período há um aumento da apoptose tanto em processo inicial , tanto em processo tardio. Avaliamos a autofagia em uma cinética de 0, 2, 6, 18 e 24 horas in vitro e observamos aumento significativo da autofagia em células da medula óssea de animais desnutridos em 0 horas e após 18 horas de estímulo com tamoxifeno (20 µM) em relação ao respectivo controle, demonstrando que nesse período a autofagia começa a ser induzida através do estimulo mais facilmente do que o controle. Autofagia é um dos principais contribuintes para o metabolismo celular, fornecendo nutrientes quando os mesmos estão indisponíveis, e, portanto, no nosso modelo de desnutrição protéica a hipoplasia medular estaria em processo autofágico como mecanismo de reparo e sobrevivência. / Malnutrition can induce cell damage, compromising the mechanisms involved in proliferation, differentiation and cell death. Studies from our laboratory have demonstrated, in a murine model of protein malnutrition and protein-energy, marrow hypoplasia with histologic evidence of alteration of the extracellular matrix. Our objective was to evaluate the possible involvement of the processes of apoptosis, necrosis and autophagy in the development of bone marrow hypoplasia observed in this model. For this we used two groups of C57BL/6J adult male kept in metabolic gaioleiro. The control group (C) received normal protein diet containing 12% protein and undernourished group (D), fed low protein diet containing 2% protein. The protein source used was casein. The induction period of undernutrition was approximately five weeks, as defined by loss of 20 to 25% of body weight per part of group malnourished. After this period, the animals of both groups were anesthetized and held the collection of biological samples for nutritional assessment and hematology and bone marrow cells collected for evaluation of apoptosis, necrosis and autophagy. For assessment of apoptosis and necrosis of the cells were double labeled with Annexina V and PI caspase 3 were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2 was quantified by Western Blotting technique. The analysis revealed no statistical difference between the groups for these parameters. For evaluation of autophagy proteins extracted from bone marrow cells and evaluated the expression of proteins Akt and phosphorylated and total mTOR, complexes of mTOR (Raptor, and Rictor Gβl), Beclin-1 and LC3II. The results showed significant increase in overall mTOR, Raptor, and LC3II Beclin-1 and decreased phosphorylation of mTOR in cells derived from malnourished animals compared to the control group. Malnutrition did not modify the expression of Akt total, but decreased phosphorylation of Akt and decreased expression of the protein Rictor and Gβl cells analyzed. As apoptotic and autophagic processes can be difficult to detect in vivo, also redid the experiments in vitro, stimulating the cells with pro-apoptotic compounds (campotecina) and pro-autophagic (tamoxifen). In these experiments we observed that, when only stimulate cells with camptothecin malnourished, the same at 12 hours had a higher percentage of initial apoptosis compared to 0 hours, suggesting that there is a period in which cells are signaled to via malnourished being more susceptible to apoptotic stimuli. The animals starved cells stimulated after 12 h showed significant increase in apoptosis compared to control late stimulated, indicating that at that time there is an increase in apoptosis both in the initial process, both late process. Autophagy evaluated in kinetics of 0, 2, 6, 18 and 24 hours in vitro and observed a significant increase in autophagy in bone marrow cells of malnourished at 0 hours and after 18 hours stimulation with tamoxifen (20 microM) than the respective control, demonstrating that this period autophagy begins to be induced by stimulating more easily than the control. Autophagy is a major contributor to cellular metabolism, providing nutrients when they are unavailable, and therefore in our model of protein malnutrition in the marrow hypoplasia would autophagic process as a mechanism for survival and repair.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-04122013-151612 |
| Date | 28 February 2013 |
| Creators | Jackeline Soares de Oliveira Beltran |
| Contributors | Primavera Borelli, Joao Gustavo Pessini Amarante Mendes, Daurea Abadia de Souza |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Farmácia (Análise Clínicas), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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