Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert
dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes
verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält
somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder
die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie
Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur
Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in
der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN
inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A
wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle
einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein.
Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des
Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau
des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und
molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu
identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn
beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde
für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN
alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und
wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde
fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur
Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden
synthetisiert.
Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN
Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI
Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays.
Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt
werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer
zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein.
Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt.
Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für
die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das
aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete
Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch
energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden.
Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden
basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht. / The association of the oncogenic transcription factor MYCN with the Ser/Thr kinase Aurora-A prevents
its degradation via the ubiquitin proteasome system by preventing the SCF FbxW7 complex from binding.
The kinase adopts an active conformation when bound to MYCN, enabling kinase activity without prior
phosphorylation on Thr288 or the presence of an activator like TPX2, and therefore at inappropriate
times during the cell cycle. As high levels of MYCN have been shown to drive cancers like
neuroblastoma, disrupting the complex formation is thought to be a viable development strategy for
chemotherapeutics. Several small-molecule inhibitors of Aurora-A, like Alisertib (MLN8237), are able to
induce a conformational change in the kinase, preventing the formation of the protein – protein complex
and therefore promoting MYCN degradation. However, since Aurora-A has important roles during
mitosis targeting only the complex could be a more promising approach than the systemic inhibition of
the kinase.
This project aimed to identify small molecules which selectively bind at the Aurora-A – MYCN interface
and can be further optimized to induce targeted degradation via a PROTAC approach. Virtual screenings
and molecular dynamics simulations were performed to identify commercially available compounds
which should bind to a pocket formed only when the two proteins come together. Of a first set of ten
potential binders, four showed binding to the Aurora-A – MYCN complex but not the individual proteins
in STD-NMR experiments. Two of these hit molecules contained the same scaffold and were used as a
starting point for optimization towards more potent ligands. In a fragment-based fashion, the scaffold
was grown to achieve better affinity in-silico and provide linkage points for functionalization such as the
attachment of E3 ligase ligands to create PROTACs. Nine of these second-generation compounds were
then synthesized.
In order to obtain quantitative binding data a covalently linked Aurora-A – MYCN construct was
designed. Its structural and functional validity was shown in STD-NMR and BLI experiments with known
Aurora-A inhibitors and in NMR-based ATPase assays. In addition, a crystal structure of the construct
was solved, validating the designed structure. Quantitative measurements with the synthesized
compounds revealed a positive hit (HD19S) with a ten-fold higher affinity to the covalently linked AuroraA – MYCN as compared to Aurora-A alone.
Additionally, effects of PROTACs designed to degrade Aurora-A were studied in-silico. Interactions
between Aurora-A, the E3-ligase Cereblon and small molecules were modelled and successfully used
to explain the differences in activities observed with different PROTACs. The most active PROTAC also
showed a high selectivity for Aurora-A over Aurora-B, even though the recognition unit (Alisertib) can
bind both family members. Through energetic analysis of molecular dynamics simulations of the ternary
complexes, these differences could be explained. Optimizations for a more efficient degradation of
Aurora-A by the PROTACs were examined by changing the recognition unit and improving linkers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:31759 |
| Date | January 2023 |
| Creators | Diebold, Mathias |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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